[发明专利]微量起始DNA的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库

说明书

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库。

背景技术

生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。第一代测序仪对电泳分离技术的依赖，使其难以进一步提高分析的速度和并行化程度，也难以通过微型化降低测序成本。经过不断的技术开发和改进，21世纪初，以Roche454技术、illumina公司的Genome Analyzer技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代技术大大降低了测序成本，还大幅度提高了测序速度并保持了高准确性。其中，illumina公司的第一台测序仪于2006年问世，之后开发出来一系列的测序仪，如Hiseq2000、Hiseq2500、Miseq、Hiseq X等，在准确性、通量、成本和速度方面表现更优秀，而使其成为全球使用量最大的第二代测序仪。在第二代测序平台不断完善的同时，以对单分子DNA进行非PCR测序为主要特征的第三代测序技术也初显端倪。但由于其关键技术问题尚待解决，目前还未得到广泛应用。

近几年来，包括人、拟南芥以及水稻等越来越多的基因组被测序，全基因组测序为重要基因的克隆、基因的系统进化和基因组学研究提供了坚实的平台。但依然有部分珍贵物种由于样本较少获取难度大，或者个体较小获得的基因组浓度较低等原因，得到的基因组DNA少(低于50ng)，按照目前现有的建库流程和方法，建库难度非常大。

目前针对低起始量DNA的建库方法主要有转座酶建库和普通流程建库，转座酶建库主要是利用转座酶随机切割基因组DNA，并在片段两端加上接头，然后进行扩增建库，该方法是一种高效的低起始量建库方法。但这种建库方法有一个较为明显的缺点，就是其使用转座酶随机切割打断过程中易受到样本中杂质的干扰，导致打断建库失败。而普通流程建库无法进行低于20ng的建库，在起始量为50ng时，在后期扩增时扩增循环数较高，需要达到18-25个循环，文库库容较低，质量较差，且建库成功率只有30％左右。

如上所述，转座酶切割打断建库的方法易受到样本质量的影响，导致切割打断失败，基因组无法正常片段化，在后续扩增中无法得到有效扩增。而普通流程建库无法进行低于20ng的建库，在起始量为50ng时，建库成功率为30％，且文库质量较差，库容低，信息分析结果显示片段重复较高。

因此，仍需要对现有技术进行改进，以改善现有的微量起始样本建库成功率较低的缺陷。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法及其所构建的高通量测序文库，以改善现有技术中微量起始样本建库成功率较低的缺陷。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种微量起始DNA的高通量测序文库构建方法，该构建方法包括：步骤S1，对样本DNA进行物理打断，得到片段化DNA；步骤S2，对片段化DNA进行末端修复及加A，得到修复DNA；步骤S3，利用连接增强剂对修复DNA进行接头连接，得到带接头片段；以及步骤S4，对带接头片段进行扩增，得到高通量测序文库；其中，增强剂为DMSO、乙醇、乙二醇或甘油。

进一步地，在步骤S2中，利用高通量测序文库构建试剂盒中的修复酶混合物进行修复，高通量测序文库构建试剂盒中的修复酶混合物包括dNTPs、T4DNA聚合酶、T4PNK和Klenow酶或Taq酶，并在修复过程中向修复酶混合物中添加dATP。

进一步地，高通量测序文库构建试剂盒包括NEB公司的DNA文库构建试剂盒、Bioo公司的DNA文库构建试剂盒或诺唯赞公司的DNA文库构建试剂盒。

进一步地，在修复过程中向修复酶混合物中添加小于等于0.4μl 100mM的dATP。

进一步地，在步骤S3之后以及步骤S4之前，构建方法还包括对带接头片段进行磁珠纯化的步骤。

进一步地，步骤S4包括：对连接片段进行分步扩增，并在每次扩增之后增加磁珠纯化的步骤，得到高通量测序文库。

进一步地，步骤S4包括：对带接头片段扩增4～7个循环，得到第一扩增片段；对第一扩增片段进行0.95～1.20倍体积的磁珠纯化，得到第一扩增纯化片段；对第一扩增纯化片段扩增6～9个循环，得到第二扩增片段；对第二扩增片段进行0.95～1.20倍体积的磁珠纯化，得到第二扩增纯化片段；以及利用0.7～0.85倍体积的磁珠对第二扩增纯化片段进行分选，得到高通量测序文库。