[发明专利]一种油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法

权利要求书

1.一种油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法，其特征在于包括以下步骤：

a.制备方法：

酸水解工艺：粗提取物与酸水解液固液比为1g∶10～100mL，加入为0.1mol/L～1mol/L HCl溶液，置于30℃～100℃的恒温水浴摇床中，水解1h～10h后，中和至中性，过滤，滤液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，得到羟基酪醇提取物；

生物酶法工艺：以橄榄苦苷降解率和羟基酪醇含量为综合考察指标，从中温淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、单宁酶、β-葡萄糖苷酶10种酶中筛选出降解橄榄苦苷制备羟基酪醇效果最好的半纤维素酶；通过酶解单因素和正交优化确定最佳工艺条件，所述最佳工艺条件为在0.1g～5g的油橄榄叶粗提取物中，加入40mg半纤维素酶，在pH为5.5、温度为60℃时，酶解6h，制备羟基酪醇提取物；

b.橄榄苦苷和羟基酪醇HPLC分析方法：称取橄榄苦苷和羟基酪醇对照品配制成混合溶液，浓度范围为0.1～10μg，选择C18色谱柱，流动相为甲醇和水比例为1∶1～10，在波长220～280nm下进样分析，以HPLC峰面积为纵坐标，橄榄苦苷和羟基酪醇质量分别为横坐标，绘制HPLC标准曲线；

c.羟基酪醇提取物质量评价：称取羟基酪醇提取物溶于甲醇，通过0.45μm有机膜滤过，采用HPLC分析，制备的羟基酪醇提取物中羟基酪醇含量2～20％。

2.根据权利要求1所述的油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法，其特征在于步骤a中酶筛选工艺：配制pH分别为3.0～7.0的磷酸盐缓冲液，称取相同酶活力的各种酶，分别对0.1g～5g油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物进行酶解，粗提取物与缓冲液固液比为1g∶10～100mL，并在各种酶的最适温度和pH下酶解2h～10h。酶解结束后，90℃灭酶10min，酶解液在5000r/min离心10min，过滤，再经乙酸乙酯萃取，然后HPLC分析橄榄苦苷和羟基酪醇含量。

3.根据权利要求1所述的油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法，其特征在于步骤a中酶解单因素工艺：取0.1g～5g的油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物样品置于100mL的锥形瓶，加入10mL～100mL磷酸盐缓冲溶液和10mg～100mg半纤维素酶，在30℃～80℃下酶解，酶解2h～10h结束后，90℃灭酶10min，酶解液在5000r/min离心10min，过滤，再经乙酸乙酯萃取，用HPLC分析滤液中羟基酪醇和橄榄苦苷，并根据标准曲线计算各含量，以橄榄苦苷降解率和羟基酪醇含量为检测指标，研究不同温度、不同pH、不同时间和不同加酶量对半纤维素酶水解橄榄苦苷效率的影响。

4.根据权利要求1所述的油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法，其特征在于步骤a中酶解正交优化工艺：在单因素试验的基础上，采用四因素三水平[L9(34)]正交实验设计，分别以温度、pH、时间、加酶量4个独立变量为考察因素，研究羟基酪醇含量目标值与影响因素间的关系，结果显示，对酶解工艺影响因素的大小为温度＞pH＞时间＞酶量，得到最佳工艺条件，得到羟基酪醇含量为5％～20％，橄榄苦苷降解率为70～95％。