[发明专利]一种油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及生物和化学领域，特别涉及油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法。

二、背景技术

油橄榄(Olea europaea L.)属木犀科(Oleaceae)、木犀榄属(Olea)常绿乔木，是世界著名的木本油料树种。橄榄油能大大降低心血管和肺癌的发病率，其营养价值和经济价值已被大家认可。生物学家进一步发现橄榄叶含有的抗氧化活性成份较之橄榄油更为突出，主要有橄榄苦苷、羟基酪醇、黄酮类、木酚素类、咖啡酰苯乙醇苷类等多酚类化合物。尤其是羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT；化学名为3，4-二羟基苯乙醇)，清除自由基的能力强，表现出独特的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗炎、改善心脏的冠脉血流等。而且还能抑制人类早幼细胞白血病细胞HL60、腺癌细胞HT29及HT29克隆体19A、女性乳腺癌MCF-7细胞等扩散，透过阻滞肿瘤细胞的循环及诱发其凋亡，具有很好的抗癌活性。

天然羟基酪醇在橄榄叶中含量很低，仅有0.01-0.8％，大多数以酯化物(橄榄苦苷)的形式存在于油橄榄的各个部位。目前HT主要是从橄榄果、叶，以及在制备橄榄油或餐用橄榄果过程中产生的残渣和废水中分离的，而废水中橄榄苦苷、女贞苷、毛蕊花苷等糖苷、黄酮苷及多酚类物质成分复杂，分离效率低。以化学合成HT已有报道，Lucia和Napolitano等在-25℃下，酪醇经IBX氧化和硫代硫酸钠还原得到HT，收率仅为30％；以3，4-二羟基苯乙酸作为原料，以氢化铝锂，TMSCHNH/硼氢化钠，四正丁基硼烷化胺/碘甲烷为还原剂，收率都低于50％，而且原料和催化剂成本昂贵，反应条件苛刻，无法工业化制备。

橄榄苦苷(Oleuropein，OE)结构为裂环烯醚类多酚化合物，极易受空气、阳光、酸、碱、氧化剂、过渡金属离子、长时间高温等因素的影响，发生氧化、缩合、螯合等反应遭受破坏，尤其是在酸、碱和酶的作用下易降解为HT和榄香酸，如下式所示。

油橄榄果及叶中OE含量高，尤其在叶中达到10～17％。因此利用油橄榄OE降解制备天然HT是国内外研究热点。W02008136037报道酸催化的降解方法需要硫酸催化剂，Ghayth Rigane对比了酸水解和碱水解橄榄枯饼“alperujo”中OE的化学处理工艺。意大利研究人员利用固定化的嗜高温β-葡萄糖苷酶(pH＝7.0，60℃)降解OE，并从复杂的酶解混合物中分离出未酶解的OE、HT和榄香酸。该方法使用的酶价格昂贵，且反应条件必须是嗜高温。所以进行水解橄榄苦苷的方法研究显得尤为重要，本研究关键在于各种水解方法对橄榄苦苷作用的比较，同时最佳酶解效果和经济适用、条件温和的酶系筛选以及降解油橄榄叶橄榄苦苷制备羟基酪醇酶解工艺的优化。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种油橄榄叶橄榄苦苷粗提取物制备羟基酪醇的方法，本发明的技术方案是采用如下步骤来实现：

3.1制备方法：

酸水解工艺：粗提取物与酸水解液固液比为1g∶10～100mL，加入为0.1mol/L～1mol/L HCl溶液，置于30℃～100℃的恒温水浴摇床中。水解1h～10h后，中和至中性，过滤，滤液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，得到羟基酪醇提取物；

碱水解工艺：粗提取物与酸水解液固液比为1g∶10～100mL，加入0.1mol/L～1mol/L NaOH溶液，置于30℃～100℃的恒温水浴摇床中。水解1h～10h后，中和至中性，过滤，滤液经乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩干燥，得到羟基酪醇提取物；

生物酶法工艺：以橄榄苦苷降解率和羟基酪醇含量为综合考察指标，从中温淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、木瓜酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶、单宁酶、β-葡萄糖苷酶10种酶中筛选出降解橄榄苦苷制备羟基酪醇效果最好的半纤维素酶；通过酶解单因素和正交优化确定最佳工艺条件，制备羟基酪醇提取物。