[发明专利]一株产天冬氨酸脱羧酶的菌株及用于生产丙氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一株生产L-天冬氨酸α-脱羧酶的菌株，以及利用该菌株生产的L-天冬氨酸α-脱羧酶发酵液催化制备β-丙氨酸的方法。

背景技术

β-丙氨酸是天然存在的唯一β型非蛋白氨基酸，用于合成肌肽、泛酸钙、巴柳氮及帕米磷酸钠等医药产品，用途非常广泛。目前β-丙氨酸主要采用化学合成法，成本高、条件及生产环境不友好等缺点，开发绿色安全的生物法生产工艺将具有十分明显的经济和社会效益。L-天冬氨酸α-脱羧酶（L-aspartateα-decarboxylase，EC4.1.1.11，PanD）是泛酸生物合成途径中的关键酶，催化L-天冬氨酸脱羧基生成β-丙氨酸，利用该酶以廉价的L-天冬氨酸为原料可以实现β-丙氨酸绿色高效的工业生产。

PanD在大肠杆菌（Escherichiacoli）、结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）及幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)等微生物中均有存在，目前研究较多的是大肠杆菌和结核分枝杆菌。国内外研究者利用上述菌株做了很多研究工作，如美国NSC技术有限公司扩增表达了E.coli来源的PanD基因，测得该酶酶活为0.115mmol/g·h，Chopra等人扩增了致病菌Mycobacteriumtuberculosis来源的PanD基因并在E.coliBL21(DE3)中表达，粗酶液酶活达到0.035mmol/g·h，高丽娟等将E.coliDH5α来源的panD在E.coliBL21（DE3）中表达构建工程菌，酶活为224.96U/L；洪敏等将E.coliDH5apanD连接到pET28c(+)载体，转化E.coliBL21(DE3)，经诱导培养重组菌酶活为186U/L发酵液。以上报道受限于较低的酶活力，距离工业化应用尚有较大的距离。

发明内容

本发明的目的是提供从葡萄园中分离得到的一株高效生产L-天冬氨酸α-脱羧酶的菌株，并应用该菌株产生的L-天冬氨酸α-脱羧酶酶法制备β-丙氨酸的方法。

本发明所提供的产L-天冬氨酸α-脱羧酶的菌株是从烟台地区葡萄园土壤中分离得到，这是一株L-天冬氨酸α-脱羧酶分泌能力极高的菌株，培养方法简单，生长速度快，不易变异，可以直接用于酶法制备β-丙氨酸。将其编号为PanD37，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2015年2月2日，分类命名为特基拉芽孢杆菌（BacillustequilensisPanD37），保藏编号为：CGMCCNo.10506。该菌株的16SrDNA基因序列已递交到了GenBank数据库。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16SrDNA基因序列进行比较，结果表明菌株PanD37与Bacillustequilensis相似度最高，达到99%。

本发明所述菌株的L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵生产及用于催化制备β-丙氨酸的方法如下：

1、培养基配制

（1）固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；（2）液体种子培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；（3）发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，天冬氨酸2g/L，MgSO₄0.2g/L，硫酸铵3g/L，KH₂PO₄0.5g/L，pH7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min；

2、菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱30℃培养14～20h；

3、液体种子制备：挑取1环活化菌株接种于装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，八层纱布封口，于30℃，160～200r/min摇床振荡培养12～24h，得液体种子；

4、液体发酵：按5～10%接种量向发酵培养基接入液体种子，转速200～700r/min,溶氧控制20～50%，pH7.0～7.5，温度25～37℃，通气培养24～48h，得到L-天冬氨酸α-脱羧酶的发酵液；