[发明专利]一种利用黄腐酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用黄腐酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法。

背景技术

天然虾青素(3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素)是目前自然界发现的最强的抗氧化剂。天然虾青素来源自发夫酵母、鲑鱼、虾壳及雨生红球藻中，而雨生红球藻中含有丰富的虾青素，可达其干重的4％，被誉为天然虾青素的浓缩品。虾青素的抗氧化活性主要体现在一方面它是类胡萝卜素的最高级衍生物；另一方面其共轭双键末端具有不饱和的酮基和羟基，由此基团构成α-羟基酮，因此它要强于一般的类胡萝卜素的抗氧化性。天然虾青素对人体无任何毒副作用，虾青素的抗氧化活性使得其在医药、化妆品和保健品等有很大的应用潜力，另外虾青素也可以作为水产动物的饲料添加剂以及食品添加剂。

雨生红球藻属于一种单细胞绿藻，它只有在胁迫条件下，比如高温、强光照、氮饥饿等，能够大量的积累虾青素。而关于刺激雨生红球藻产虾青素的诱导大多集中在物理和化学因子上，较少有关于植物激素的研究。黄腐酸作为一种植物生长调节剂，能够促进植物生长，具有很强的抗逆作用，而雨生红球藻正是在这种胁迫下才大量积累虾青素。外援添加黄腐酸能激发植物防御基因的表达，诱导植物的化学防御，与机械损伤和昆虫取食相似的效果。因此黄腐酸可能会诱导雨生红球藻大量积累虾青素。

目前国内已经有规模化生产虾青素的公司，也已有了一些相关的技术和专利，比如“雨生红球藻的培养生产方法”(201210295602)公开了一种利用光生物反应器培养雨生红球藻的方法，包括不同LED光源的和二氧化碳调节pH值培养绿色细胞的方法。湖北师范学院的“一种雨生红球藻高密度培养的气升式光生物反应器”(CN200510018203.4)，公开了一种雨生红球藻高密度培养的气升式光生物反应器，包括养殖罐、水处理装置、照明装置、气体供应装置,通过调控反应条件实现全天候高密度养殖，并将藻的养殖和虾青素积累结合在同一反应器中完成。天津大学的“用酵母发酵残液培养藻类生产虾青素的方法”(CN1480524A)，公开了一种利用酵母发酵残液生产虾青素的方法，是向酵母发酵残液中加入无机盐配成培养基，在特定的容器内培养雨生红球藻或绿球藻，经过分离提取虾青素。上述相关专利技术虽然先进，但是工艺较为复杂，设备要求高，操作较为繁琐，这就增加了生产的成本和技术推广的难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用黄腐酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，该方法的不仅操作简单、成本低，而且可很大程度上缩短积累虾青素的周期及提高虾青素的产率。

本发明所采用的技术方案是，一种利用黄腐酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：

步骤1、藻液的制备：培养雨生红球藻到对数生长期后期，用缺氮的BG-11培养基稀释藻液并获得诱导的藻液；

步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：用纯水配成10g L^-1的黄腐酸母液，将黄腐酸母液添加到已经稀释好的诱导的藻液中使黄腐酸浓度达到4.95-5.05mg L^-1；然后将上述藻液进行培养，待藻体细胞完全变红后，收集藻细胞；

步骤3、利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素。

本发明的特点还在于：

雨生红球藻为雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU。

步骤1中藻液的制备具体为：在24-26℃、光强2900-3000lx，持续光照条件下培养，培养雨生红球藻到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到10⁶cells mL^-1，利用缺氮的BG-11培养基稀释到2×10⁵cells mL^-1作为诱导藻液。

步骤2中诱导雨生红球藻积累虾青素中的培养条件为：26-28℃、光强9500-10000lx、冷光灯连续光照及饥饿营养盐的复合胁迫。

步骤3中利用有机溶剂提取藻细胞的虾青素具体为：取5ml上述藻液，4000r/min离心5min，弃上清得藻细胞沉淀；分别向藻细胞沉淀中加入2mL30％甲醇和5％KOH混合液，60℃水浴15min，4000r/min离心10min，除上清，沉淀加入纯水洗涤2次，除碱液残留；然后加入5mL DMSO，200w超声破壁15min，其中，超声1min，10s间歇，于45℃水浴20min，抽提至藻体发白，离心收集上清测OD490；并按照公式计算得出虾青素的含量，其中C为虾青素含量，A为490nm下OD值，Va为DMSO体积，Vb为藻液体积。