[发明专利]转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法

权利要求书

1.转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法，其特征在于它的转化方法：

步骤一：材料准备

首先获得GFP质粒、高粱靶斑病菌菌株；PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g；TB3培养基：酵母抽提物3g，酪蛋白氨基酸3g，蔗糖20％，琼脂7.5g；

步骤二：高粱靶斑病菌原生质体制备与转化

取5mm×10mm的菌丝块，切碎后置于PDA液体培养基中，28℃，160r/min，黑暗下振荡培养2d；过滤菌丝，将菌丝置于含细胞壁裂解酶的0.7M NaCl中，在30ml 0.7M NaCl中加入0.3g溶 壁酶、0.1g蜗牛酶和0.1g崩溃酶,30℃，60r/min振荡培养6h以上；过滤上述液体并分装于2ml的离心管中，6000r离心5min；弃上清，加入1ml 0.7M NaCl，悬浮原生质体，6000r离心5min；弃上清，加入适量0.7M NaCl，镜检观察原生质体数量，加入10μl GFP质粒，室温静置20min；加入1ml PEG，PEG浓度为20％,室温静置20min；将上述液体倒入10ml管中，并加入5ml液体再生培养基，28℃，60r/min过夜振荡培养；倒板：将过夜培养的原生质体倒入50℃的固体再生培养基，固体再生培养基为TB3，培养基中博莱霉素浓度为50mg/L；覆盖：晾干后，再用50℃的再生培养基覆盖一层，博莱霉素浓度为倒板时的2倍；待转化子长出培养基后，挑于PDA板上，并用PCR和荧光鉴定突变体。