[发明专利]转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法

说明书

本发明涉及PEG介导的原生质体转化技术领域，具体涉及转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法。将高粱靶斑病菌菌丝置于30ml 0.7M NaCl中（含融壁酶0.3g，崩溃酶0.1g），30℃，60r，黑暗条件下过夜裂解能够得到较多的原生质体，将GFP质粒与原生质体混合后用20%的PEG处理25min介导其转化并以TB3为再生培养基可以较快较多的获得转化子，最后经荧光和致病性鉴定，成功获得了转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体。它建立了PEG介导的高粱靶斑病菌原生质体转化体系，为了研究高粱靶斑病菌的基因功能并为揭示其致病机制奠定基础。

技术领域

本实用新型涉及PEG介导的原生质体转化技术领域，具体涉及转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法。

背景技术

高粱靶斑病的病原菌为平脐蠕孢菌(Bipolaris Sorghicola)，病菌的分生孢子微弯，两端钝圆，有3-7个横隔膜，分生孢子脐点明显可见且与基部边缘平齐。在自然界中，该病菌以菌丝体和分生孢子在土壤或高粱秸秆上越冬；翌年条件适宜时，分生孢子萌发形成附着胞，从叶表皮侵入寄主；病菌在寄主内扩展并可形成新的分生孢子从寄主表皮细胞间生出，孢子再借风雨传播反复侵染。自1939年高粱靶斑病被首次报道以来，其后又在塞浦路斯、印度和菲律宾等高粱产区相继发现。目前，该病已经成为高粱的主要叶部病害之一，严重时可造成高粱减产高达50％。平脐蠕孢菌除了能对高粱致病外，还是其他多种作物病害的病原菌，如水稻胡麻叶斑病、小麦根腐病和玉米小斑病等。

一般的植物病原菌在接触寄主表面后，接受不同的胞外信号，并通过环腺苷酸、丝分裂原激活蛋白激酶以及Ca2+等物质介导的信号转导途径来调控附着胞的分化和发育，并通过附着胞来侵入寄主细胞。在平脐蠕孢菌中，已经有一些信号转导途径相关基因的功能得到鉴定。Moriwaki等在水稻平脐蠕孢菌中发现了一个MAPK途径的编码基因SRM1，该基因对活性氧、过氧化氢及紫外线胁迫具有重要作用。随后，他们又发现了一个对该病原菌的致病性有重要作用的MAPK途径编码基因BMK1。该基因缺失突变体的菌丝生长速率与野生型相比明显下降，且无法产生分生孢子，并最终导致致病性完全丧失。Ste7是玉米大斑病菌的一个MAPK编码基因，该基因对其菌丝生长无明显影响，但是在无性和有性繁殖方面具有重要作用。ΔSte7无法产生子囊壳导致有性生殖过程受阻，且菌丝形成的分生孢子功能不完整，无法产生附着胞，导致致病性下降。Izumitsu等研究发现玉米小班病菌的MAPKKK编码基因ChSte11能够通过影响分生孢子的萌发、黑色素的合成及附着胞的形成导致致病性降低。

高粱靶斑病菌的基因功能和致病性研究还鲜有报道，本文通过PEG介导的原生质体转化技术成功将GFP质粒转入到高粱靶斑病菌中，并成功获得了转GFP基因的突变体。该体系的建立可为高粱靶斑病菌的致病基因研究提供帮助，进而为揭示其致病机制奠定基础。

实用新型内容

本实用新型的目的是提供转GFP基因的高粱靶斑病菌突变体的转化方法，它建立了PEG介导的高粱靶斑病菌原生质体转化体系，为了研究高粱靶斑病菌的基因功能并为揭示其致病机制奠定基础。

为了解决背景技术所存在的问题，本实用新型是采用以下技术方案：它的转化方法：

步骤一：材料准备

首先获得GFP质粒、高粱靶斑病菌菌株；PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g；TB3培养基：酵母抽提物3g，酪蛋白氨基酸3g，蔗糖20％，琼脂7.5g；

步骤二：高粱靶斑病菌原生质体制备与转化