[发明专利]无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法

权利要求书

1.无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将lamda噬菌体基因组DNA加入待测样品的基因组DNA中；用限制性内切酶对待测样品的基因组DNA酶切，获得5’末端具有磷酸化修饰的平末端DNA片段；添加碱基A，获得具有3’粘性末端A的DNA片段；

(2)将步骤(1)获得的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连，获得可以区分样品来源的连接产物；

(3)纯化含有不同条形码的连接产物；将连接产物分为两份，一份作为对照组直接进行PCR扩增，另一份作为处理组经过重亚硫酸盐转化后再进行PCR扩增，获得两组含有相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；分别纯化两组PCR扩增产物，定量后混合每组的PCR扩增产物；将两组混合后的PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶分离纯化，选择相同的特定长度片段序列切胶回收；

(4)特定长度片段的两组产物分别低循环PCR扩增，对目的片段范围内的序列进行富集；两组低循环扩增产物分别进行琼脂糖凝胶分离纯化，纯化产物构成简化甲基化测序文库。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述待测样品可以来自相同或不同的物种，样品数目≥1；

其中，步骤(1)按照质量比1:1000将λDNA加入待测样品的基因组DNA中；

步骤(3)的PCR扩增所采用的引物与步骤(4)的低循环PCR扩增所采用的引物相同，均为根据步骤(2)的甲基化接头的序列设计得到。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述限制性内切酶是甲基化不敏感型限制性内切酶。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述限制性内切酶是一种平末端限制性内切酶，或多种平末端限制性内切酶的组合，其酶切产生的限制性片段是具有5’末端磷酸化修饰的平末端DNA片段；

步骤(2)所述的含有不同条形码序列的甲基化接头是指接头序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰且含有条形码序列。

5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述的定量后混合每组的PCR扩增产物是根据测序深度的要求按照设定的质量比例将每组的PCR扩增产物进行混合；当待测样品数为1时，则无需混合。

6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述选择相同的特定长度片段序列是指大小为350-650bp的序列。

7.权利要求1所述的构建方法构建得到的高通量简化甲基化测序文库。

8.权利要求7所述的高通量简化甲基化测序文库在无参考基因组样品的高通量甲基化状态研究中的应用。