[发明专利]无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物信息学技术领域，具体地说，涉及一种无参考基因组物种简化甲基化测序文库的构建方法。

背景技术

DNA甲基化是重要的表观遗传学修饰，在细胞发育和分化、调控基因表达、X染色体失活、基因沉默、疾病的发生等方面扮演着重要的角色，是目前新的研究热点之一。基于二代测序技术发展起来的DNA甲基化检测技术可以提供大量的高通量、全基因组DNA甲基化数据，极大地推动了表观遗传学研究的发展。重亚硫酸盐转换结合二代测序技术是目前最精准的DNA甲基化检测方法，能够检测单碱基水平的甲基化状态，被称为DNA甲基化检测的“金标准”。对基因组中未发生甲基化的胞嘧啶进行重亚硫酸盐处理，将其转换成U，经PCR扩增后变成T，重亚硫酸盐转换对甲基化的胞嘧啶不起作用；通过结合二代测序，即可绘制出单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。目前常用的重亚硫酸盐转化结合二代测序技术的DNA甲基化检测技术有全基因组甲基化测序(Bisμlfite Sequencing，BS－seq)和简化代表性重亚硫酸盐测序(Reduced Representation Bisμlfite Sequencing，RRBS)。由于要确定甲基化的胞嘧啶的位点必须将重亚硫酸盐转化后的序列与参考基因组进行比较，因此，这两种技术目前只能用于人、小鼠、大鼠等有高质量参考基因组序列的物种，同时还存在着BS－seq建库成本高、RRBS所需限制性内切酶MspI酶切效率低等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案流程图见图1。

具体地，本发明提供的无参考基因组高通量简化甲基化测序文库的构建方法，包括以下步骤：

(1)将λDNA加入待测样品的基因组DNA中；用限制性内切酶对待测样品的基因组DNA酶切，获得5’末端具有磷酸化修饰的平末端DNA片段；添加碱基A，获得具有3’粘性末端A的DNA片段；

(2)将步骤(1)获得的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头相连，获得可以区分样品来源的连接产物；

(3)纯化含有不同条形码的连接产物；将连接产物分为两份，一份作为对照组直接进行PCR扩增，另一份作为处理组经过重亚硫酸盐转化后再进行PCR扩增，获得两组含有相同条形码、仅在无甲基化的胞嘧啶位点不同的扩增产物序列；分别纯化两组PCR扩增产物，定量后混合每组的PCR扩增产物；将两组混合后的PCR扩增产物分别进行琼脂糖凝胶分离纯化，选择相同的特定长度片段序列，切胶回收；

(4)特定长度片段的两组产物分别低循环PCR扩增，对目的片段范围内的序列进行富集；两组低循环扩增产物分别进行琼脂糖凝胶分离纯化，纯化产物构成简化甲基化测序文库。

上述方法中，步骤(1)所述待测样品可以来自相同或不同的物种，样品数目≥1。

其中，步骤(1)按照质量比1:1000将lamda噬菌体基因组DNA(λDNA)加入待测样品的基因组DNA中。λDNA为本领域已知的用于评估重亚硫酸盐转化效率的商品化DNA。

本发明方法中，步骤(1)所述限制性内切酶是甲基化不敏感型限制性内切酶。甲基化不敏感型限制性内切酶酶切不完全率低，保证样品间酶切片段的一致性。本发明采用的限制性内切酶是一种平末端限制性内切酶，或多种平末端限制性内切酶的组合，其酶切产生的限制性片段是具有5’末端磷酸化修饰的平末端DNA片段。实施例中采用的限制性内切酶是平末端限制性内切酶HaeIII。

本发明方法中，步骤(2)所述的含有不同条形码序列的甲基化接头是指接头序列中的胞嘧啶经过甲基化修饰且含有条形码序列。该含有不同条形码序列的甲基化接头可以通过商业途径购买得到。

进一步地，步骤(2)的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段分别与含有不同条形码序列的甲基化接头的连接方法为混合体系置于20℃恒温金属浴孵育30min，65℃失活20min。本领域技术人员应当理解，连接反应的温度和时间根据所采用的连接酶来确定，并不局限于本申请所列的连接酶和连接的温度和时间等条件参数。

本发明方法中，步骤(3)的PCR扩增所采用的引物与步骤(4)的低循环PCR扩增所采用的引物相同，均为根据步骤(2)的甲基化接头的序列设计得到。

进一步地，本发明实施例中，步骤(3)和步骤(4)PCR扩增所采用的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。