[发明专利]一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法

权利要求书

1.一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1)、颗粒细胞的预处理：

将临床采集分离得到的颗粒细胞首先采用体外培养的方法进行增殖，放入37℃、含体积含量5﹪CO₂的细胞培养箱培养2～7天，每2天更换培养基一次；取对数生长期的细胞，采用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液；

所述的体外培养采用的培养基为在TCM199培养基中加入体积含量10﹪胎牛血清、体积含量0.1﹪青霉素-链霉素混合物；

步骤(2)、将生物水凝胶与预处理后的颗粒细胞混合均匀，作为3D打印用墨水；其中每mL生物水凝胶加入10⁵～10⁷数量的颗粒细胞；

步骤(3)、由于生物水凝胶的选择不同，采用不同成熟凝胶化手段，将3D打印用墨水制成3D打印用凝胶；

步骤(4)、采用生物3D打印的方法将步骤(3)得到的3D打印用凝胶打印成具有生产工艺需求形状的产品，即人造卵泡；

步骤(5)、在步骤(4)打印完成的产品中加入含体积百分含量≥10﹪人成熟卵泡液的培养液中，培养24～48h后得到人造颗粒细胞半球；

其中所述的培养液为：TCM199培养基，0.075IU/mlFSH，0.15IU/mlhCG，0.2μg/ml的17β-雌二醇，体积含量10﹪FCS，体积含量≥10﹪处理后的人成熟卵泡液；

步骤(6)、在步骤(5)得到的人造颗粒细胞半球中加入未成熟卵母细胞-卵丘颗粒细胞复合体，然后采用3D细胞培养的方式培养24～48小时来帮助其成熟，最后得到成熟卵母细胞。

2.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述的胰蛋白酶与对数生长期的细胞的体积比为1:3。

3.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述的青霉素-链霉素混合物含有青霉素100U/ml，链霉素0.1mg/ml。

4.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述的颗粒细胞是指卵泡中卵母细胞四周围绕着的菱形或扁平的细胞浆中含有颗粒的细胞。

5.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述的生物水凝胶可以但不局限为：海藻酸钠、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、透明质酸、层粘联蛋白中的一种。

6.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于步骤(4)所述的生物3D打印采用0.5mm口径的喷嘴。

7.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于步骤(5)所述的人成熟卵泡液的处理过程是首先将卵泡液离心，56℃灭活，0.22μm过滤，-20℃低温保存备用。

8.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于步骤(6)所述的未成熟卵母细胞-颗粒细胞复合体具体是从人卵巢中取出的未成熟卵母细胞以及其上包围的颗粒细胞的复合物。