[发明专利]一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物3D打印技术领域，涉及生物材料的机械加工及其应用，具体是一种利用3D打印技术制备人造卵泡来促进未成熟卵母细胞体外成熟的方法。

背景技术

据统计，我国育龄人群中不孕不育率已高达12.5﹪，全国有近5000万不孕不育患者，成为了一个重大的社会问题，值得整个社会高度重视。现代辅助生殖(IVF)的提出为不孕不育患者解决生育问题带来了希望，通过控制性超排卵获得更多可利用的成熟卵母细胞，再通过精子显微注射技术进行人工体外受精，最后将体外培养的受精卵植回女性子宫中发育成胚胎。然而超促排卵药物的高昂费用以及频繁的就诊次数增加了患者的负担，此类药物对卵巢的刺激更可能导致恶心、腹痛、情绪不佳、闭经、卵巢过度刺激综合症(OHSS)以及潜在的致癌风险。因此将未成熟的卵母细胞进行体外培养后，再进行体外受精和胚胎移植，最终获得妊娠成为了一条可行的解决方案。这一体外培育未成熟卵母细胞的技术的提出，可以规避上述的种种副作用和并发症发生的可能性，同时简化治疗流程，减少就诊率，降低医疗费用，可以大大减轻患者的负担。因此对于该项技术的研究可以为部分不孕患者提供一条新的治疗途径，具有广泛的临床应用价值。

多囊卵巢综合症(PCOS)是一种生殖功能障碍与糖代谢异常并存的内分泌紊乱综合症，是女性不孕的一大原因。其主要特征是持续性无排卵以及产生多个不成熟卵泡。研究表明，PCOS症下的不成熟卵泡中的卵母细胞，经过体外培养后可以转化为成熟卵母细胞，经过体外受精后可以产生妊娠。因此卵母细胞体外成熟技术的研究也为解决由PCOS所导致的女性不育问题提供了一条出路。

目前卵母细胞体外培养的方法主要是将卵母细胞与颗粒细胞的混合物吸出后用透明质酸酶剥离卵母细胞周围的颗粒细胞，再将卵母细胞移植到平皿中，加入模拟卵泡液进行二维贴壁式培养。但是因为促进卵母细胞体外成熟的机制尚不清楚，采用二维贴壁式培养下获得的卵母细胞成熟质量、卵裂率、受精率和种植率均不尽如人意。其原因很可能是因为体外二维培养条件和培养液中所含的成分不支持卵母细胞完成复杂的成熟过程，卵母细胞存在胞核和胞质不能同步成熟的问题。因此选择一个更加接近于人体内卵泡微环境的培养系统是IVM成功的关键。

在人体中，卵母细胞所处的卵泡微环境是由颗粒细胞以及各种促性腺激素所组成的动态微环境，其中卵母细胞需要通过卵丘颗粒细胞提供发育所必需的营养物质和调节信号，以增加卵母细胞的表面积，借助旁分泌作用调节卵母细胞的发育。一项研究发现，体外培养小鼠裸卵只有少量可以逐步发生生殖泡破裂(GVBD)，但不足以最终完成减数分裂。而含有卵丘颗粒细胞的颗粒细胞-卵母细胞复合体在hCG、EGF、FSH、LH等激素的共同作用下培养13-15天后，有高达86﹪-95﹪的细胞会发生GVBD，并能够完成减数分裂。颗粒细胞所分泌的生长因子与激素类物质可以直接作用并导致卵母细胞的成熟，因此创造一个含颗粒细胞的卵母细胞体外促成熟模型就显得非常有必要。这一体外模型，可以帮助我们更好得认识颗粒细胞对于卵母细胞体外成熟所起的重要作用，研究卵母细胞体外成熟的分子机制，从而构建更加科学合理的卵母细胞体外培养促成熟系统。

现有的研究表明，很多因素可能影响到卵母细胞的体外培养促成熟过程。促性腺激素(黄体生成素和卵泡刺激素)对于卵泡的发展是必需的。卵泡刺激素(FSH)可以使得卵丘颗粒细胞扩展，中断卵丘细胞核卵母细胞之间的连接，阻碍卵丘颗粒细胞内的信号传入卵母细胞从而解除其对卵母细胞减数分裂的抑制作用。黄体生成素(LH)可以通过旁分泌途径诱导颗粒细胞分化，刺激卵母细胞合成周期素B，进而激活成熟分裂促进因子(MPF)，使得核膜破裂和组蛋白I磷酸化，促使染色体浓缩和纺锤体的形成，使得卵母细胞恢复成熟分裂。

因此创造出一个含有颗粒细胞以及各种生长因子与激素类物质的卵母细胞体外培养体系，能够使我们更加清楚得认识这些物质在IVM过程中所扮演的角色，有助于提高IVM的成功率。

三维打印技术是目前科学研究的一个热点。它能够借助计算机图形辅助设计，采用分层加工、叠加成形，能够构建出多样性、复杂三维结构的快速成型技术。近年来该项技术在生物医学多孔材料、组织工程的应用备受重视，尤其是在形态复杂人工骨、可控药物释放模型、多细胞联合打印组织和器官构建等领域具有其独特优势。通过优化控制打印材料及环境条件，活细胞打印、二元细胞乃至多种细胞联合打印和长期共培养均成为现实。