[发明专利]一种原子力显微镜检测单分子水平分子间相互作用的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原子力显微镜检测单分子水平分子间相互作用的方法。

背景技术

单分子检测(single molecular detection，SMD)是近十年来迅速发展起来的一项超灵敏检测技术。常规分子检测技术仅能得到一般物质的整体属性，无法准确、有效地表达单个分子及单个分子之间的相互作用。而很多生物分子(如蛋白质、DNA、RNA等)都有多种构象，且分子之间具有相互作用。因此，从单分子水平检测生物分子，对识别、分类和定量描述生物分子，实时监测化学反应途径，在生理条件下探测生物分子并提供分子结构和功能之间的信息具有重要意义。

单分子检测是在纳米级空间尺度检测有限个数目的分子或分子相互作用的事件。采用原子力显微镜的酶促反应可实现纳米或微米精密度下固相载体表面靶分子的可控固定。酶促纳米加工刻蚀技术可提供酶促反应产物随AFM探针移动而重新沉积时的形貌信息。例如，可通过在AFM探针上固定活性酶分子，以除去预先存在的生物分子或者将其转化为小分子，得到底片图像。为实现高通量和柔性分子印刷，浸蘸笔纳米加工刻蚀技术(dip-pen nanolithography，DPN)和微接触印刷技术已应用于多元DPN和多聚物笔加工刻蚀技术，并可通过原子力显微镜或荧光成像可视化。由于这些技术涉及到纳米级操作，因此需要建立可控方法以实现单个分子在基底表面特定位置的固定。原子力显微镜技术可将单个分子固定于指定位置，已应用于单分子和其他单分子力学光谱技术的研究。

现有技术中没有通过采用原子力显微镜直接测量DNA之间的相互作用力，实现单分子水平上监测DNA双链在切刻内切酶作用下发生的剪切反应，该现状亟待解决。

发明内容

本发明的目的是提供一种原子力显微镜用于检测单分子水平分子间相互作用的方法，通过采用原子力显微镜直接测量DNA之间的相互作用力，实现了单分子水平上监测DNA双链在切刻内切酶作用下发生的剪切反应，为研究单分子水平上的酶促反应提供了一种新方法。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种原子力显微镜用于检测单分子水平分子间相互作用的方法，在基底表面修饰DNA1和在AFM探针上修饰DNA2；当AFM探针与基底表面靠近时，通过DNA1与DNA2的互补杂交，形成DNA1/DNA2双链结构；采用切刻内切酶特异性识别双链DNA1/DNA2中的特定序列，并将单链DNA1切断；然后采用原子力显微镜检测DNA之间的作用力。

包括以下步骤：

(1)AFM探针修饰DNA2：将AFM探针进行羟基化修饰，得到羟基修饰的AFM探针，然后活化羟基修饰的AFM探针，将活化后的AFM探针与氨基修饰的DNA2进行固定反应，取出AFM探针，对AFM探针进行后处理。

(2)金基底上固定DNA1：预处理金基底，将处理好的金基底与巯基修饰的DNA1进行固定反应，37℃反应3小时以上。

(3)原子力显微镜测力：将缓冲溶液3滴在步骤(2)中得到的金基底上，将液滴固定在原子显微镜的扫描器上，测DNA之间的相互作用力F1；使用切刻内切酶时，将含有1×切刻内切酶缓冲液、切刻内切酶和所述缓冲溶液3的混合溶液，滴加到金基底上，将液滴固定在原子显微镜的扫描器上，测DNA之间的相互作用力F2；从而检测出DNA双链在切刻内切酶剪切前后DNA之间相互作用力的变化。

步骤(1)中，所述羟基化修饰的过程为：将AFM探针浸泡在浓硫酸和双氧水的混合溶液中(浓硫酸(质量分数95～98％)：双氧水(质量分数30％)＝7:3(体积比))30分钟，去离子水洗净，得到羟基修饰AFM探针。

步骤(1)中，所述活化过程为：将羟基修饰的AFM探针浸泡在200μl浓度为100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液中(注意：NHS溶液现用现配)，避光放置30分钟后，去离子水冲洗干净。

步骤(1)中，后处理的过程为：先用缓冲溶液2冲洗三次，再用去离子水洗净，空气中干燥30分钟。所述缓冲液2的组成：300mM NaCl，20mM Na₂HPO₄，2mM乙二胺四乙酸，7mM十二烷基硫酸钠，pH＝7.4；作用：用于清洗AFM探针。

步骤(1)中，所述固定反应的过程为：将修饰有DNA2的AFM探针浸泡在200μl浓度为1μM的氨基修饰DNA2溶液中，25℃反应12小时以上，优选为12～24小时，最优选的为16小时。