[发明专利]一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用有效
申请号: | 201510381905.2 | 申请日: | 2015-07-01 |
公开(公告)号: | CN105018603B | 公开(公告)日: | 2018-08-14 |
发明(设计)人: | 戴宗;周雪晴;邹小勇 | 申请(专利权)人: | 中山大学 |
主分类号: | C12Q1/6844 | 分类号: | C12Q1/6844 |
代理公司: | 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 | 代理人: | 胡辉;郑莹 |
地址: | 510275 *** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 三重 放大 反应 串联 恒温 指数 技术 及其 microrna 检测 中的 应用 | ||
1.一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测试剂盒,其包括:
(1)发夹探针:包括5’端颈部、环部与3’端颈部,环部与待检核酸序列互补,3’端颈部延伸至少2nt碱基作为恒温指数扩增模板区,恒温指数扩增模板区含有切口酶识别位点;
(2)恒温指数扩增引物:包括5’端序列和3’端序列,3’端序列与发夹探针的恒温指数扩增模板区互补;
(3)脱氧核酶:从5’至3’依次包括启动区与催化区;启动区为发夹结构,其环部与恒温指数扩增引物的5’端序列相同,3’端颈部至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补;催化区为锤头状核酶,其3’端至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补;
(4)脱氧核酶底物:其5'端和3'端分别标记有荧光和淬灭基团,中部含有1个核糖核苷酸,腺嘌呤核苷酸两端的序列分别与脱氧核酶启动区的3’端颈部、催化区的3’端互补。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述脱氧核酶底物中的核糖核苷酸为腺嘌呤核糖核苷酸。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述发夹探针的颈部长6-8bp。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述扩增引物的5’端至少有15nt与脱氧核酶的环部相同。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括:
(1)切口酶:其可识别发卡探针中的切口酶识别位点,并进行切割形成切口;
(2)DNA聚合酶。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括:dNTP、Mg2+。
7.一种miR-27a的恒温指数放大检测试剂盒,其包括:
(1)发夹探针:5'-TTGACTCGCGGAACTTAGCCACTGTGA AGAGTCAAA T-3';
(2)恒温指数扩增引物:5'-TTGTTATCACCTATGATTTGACTC-3'
(3)脱氧核酶:5'-AAGAGAGTTGTTATCACCTATGCTCTCTTCAGCGATCCGGAACGG CACCCATGTTAG TGA-3';
(4)脱氧核酶底物:5'-TAMRA-TCA CTATrAGGAA GAG-BHQ2-3',rA表示腺嘌呤核糖核苷酸。
8.根据权利要求7所述的miR-27a的恒温指数放大检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中还包括Nt.BstNBI切口酶、DNA聚合酶。
9.一种非疾病诊断的miRNA检测方法,包括如下步骤:
(1)将发卡探针、dNTP、恒温指数扩增引物混合制成A反应液,将A反应液于80~95℃下温育5~8分钟,然后冷却至50~55℃;
(2)将待检样品、切口酶、DNA聚合酶混合制成B反应液,加到步骤(1)的混合物中,50~55℃下温育50~60分钟;
(3)将Mg2+、脱氧核酶和脱氧核酸酶底物混合制成C反应液,加到步骤(2)的混合物中,混匀;
(4)检测步骤(3)混合物的荧光强度,根据建立的标准曲线计算待检样品中目标miRNA的含量;
所述发卡探针、扩增引物、脱氧核酶、脱氧核酶底物的序列组成如权利要求1-4、7任一项所述。
10.根据权利要求9所述的检测方法,其特征在于,各反应液的组成如下:
A反应液中含有:0.1μM发夹探针,250μMdNTP,40nM恒温指数扩增引物,0.8U·μL-1RNA酶抑制剂;
B反应液中含有:待测miRNA样品,0.5×Nt.BstNBI缓冲液,1×ThermoPol缓冲液,0.4U·μL-1Nt.BstNBI切口酶,0.32U·μL-1Bst DNA聚合酶;
C反应液含有:2mM Mg2+,2μM脱氧核酸酶底物,1μM的脱氧核酶;
A、B、C反应液的添加体积比为:10:15:5。
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