[发明专利]一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用

权利要求书

1.一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测试剂盒，其包括：

(1)发夹探针：包括5’端颈部、环部与3’端颈部，环部与待检核酸序列互补，3’端颈部延伸至少2nt碱基作为恒温指数扩增模板区，恒温指数扩增模板区含有切口酶识别位点；

(2)恒温指数扩增引物：包括5’端序列和3’端序列，3’端序列与发夹探针的恒温指数扩增模板区互补；

(3)脱氧核酶：从5’至3’依次包括启动区与催化区；启动区为发夹结构，其环部与恒温指数扩增引物的5’端序列相同，3’端颈部至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补；催化区为锤头状核酶，其3’端至少有6个碱基与脱氧核酶底物序列互补；

(4)脱氧核酶底物：其5'端和3'端分别标记有荧光和淬灭基团，中部含有1个核糖核苷酸，腺嘌呤核苷酸两端的序列分别与脱氧核酶启动区的3’端颈部、催化区的3’端互补。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述脱氧核酶底物中的核糖核苷酸为腺嘌呤核糖核苷酸。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发夹探针的颈部长6-8bp。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增引物的5’端至少有15nt与脱氧核酶的环部相同。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：

(1)切口酶：其可识别发卡探针中的切口酶识别位点，并进行切割形成切口；

(2)DNA聚合酶。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：dNTP、Mg²⁺。

7.一种miR-27a的恒温指数放大检测试剂盒，其包括：

(1)发夹探针：5'-TTGACTCGCGGAACTTAGCCACTGTGA AGAGTCAAA T-3'；

(2)恒温指数扩增引物：5'-TTGTTATCACCTATGATTTGACTC-3'

(3)脱氧核酶：5'-AAGAGAGTTGTTATCACCTATGCTCTCTTCAGCGATCCGGAACGG CACCCATGTTAG TGA-3'；

(4)脱氧核酶底物：5'-TAMRA-TCA CTATrAGGAA GAG-BHQ₂-3'，rA表示腺嘌呤核糖核苷酸。

8.根据权利要求7所述的miR-27a的恒温指数放大检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括Nt.BstNBI切口酶、DNA聚合酶。

9.一种非疾病诊断的miRNA检测方法，包括如下步骤：

(1)将发卡探针、dNTP、恒温指数扩增引物混合制成A反应液，将A反应液于80～95℃下温育5～8分钟，然后冷却至50～55℃；

(2)将待检样品、切口酶、DNA聚合酶混合制成B反应液，加到步骤(1)的混合物中，50～55℃下温育50～60分钟；

(3)将Mg²⁺、脱氧核酶和脱氧核酸酶底物混合制成C反应液，加到步骤(2)的混合物中，混匀；

(4)检测步骤(3)混合物的荧光强度，根据建立的标准曲线计算待检样品中目标miRNA的含量；

所述发卡探针、扩增引物、脱氧核酶、脱氧核酶底物的序列组成如权利要求1-4、7任一项所述。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，各反应液的组成如下：

A反应液中含有：0.1μM发夹探针，250μMdNTP，40nM恒温指数扩增引物，0.8U·μL^-1RNA酶抑制剂；

B反应液中含有：待测miRNA样品，0.5×Nt.BstNBI缓冲液，1×ThermoPol缓冲液，0.4U·μL^-1Nt.BstNBI切口酶，0.32U·μL^-1Bst DNA聚合酶；

C反应液含有：2mM Mg²⁺，2μM脱氧核酸酶底物，1μM的脱氧核酶；

A、B、C反应液的添加体积比为：10：15：5。