[发明专利]一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用

说明书

本发明公开了一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用。本发明通过设计一个特殊的颈环结构作为媒介体，触发恒温指数扩增反应（Isothermal Exponential Amplification Reaction，EXPAR），并在聚合酶的链置换反应作用下形成靶序列循环，在短时间内扩增产生大量短链DNA片段，激活脱氧核酶（deoxyribozyme），切割荧光底物，形成靶序列循环，恒温指数放大反应，以及脱氧核酶催化反应三重循环放大过程的串联，建立更为高效、快速的恒温指数放大技术，并将其应用于microRNA的超灵敏荧光检测。

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一种长度为18-23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，广泛存在于病毒、植物和高等哺乳动物的细胞中，在动植物的发育、细胞生长分化和凋亡、脂肪代谢等生命活动过程中发挥重要的调控作用。MiRNA突变或异位表达与多种人类癌症相关，可起到肿瘤抑制基因或癌基因的功能，在癌症的诊断和治疗中可起重要作用。因此，建立快速、准确、高选择性和高灵敏度的miRNA检测方法，对深入研究miRNA的功能和调控作用，以及疾病的诊治，药物开发等均具有重要意义。然而，成熟的miRNA一般只有二十几个碱基，同族的miRNA之间通常只有一两个碱基的差别，而且绝大部分miRNA在细胞内的表达水平比较低，为准确灵敏检测miRNA提出严峻挑战。

当前，miRNA的常规检测方法有Northern印迹法、微阵列法等。Northern印迹法是最早被用于评价和定量检测miRNA表达的方法，也是现在检测miRNA表达水平最主要的手段之一。虽然经过多年的发展和改进，该方法仍然无法克服操作繁琐、费时费力、灵敏度低、样品需要量大等不足。微阵列技术可实现高通量、多组分同时检测，但其灵敏度和选择性较差，且实验和仪器费用较高。基于聚合酶链反应(PCR)的技术因其快速、简单、灵敏的优点常用于微量核酸物质的检测，但由于需要依赖精确的热循环控制仪器，不仅增加了检测成本，而且对于短链DNA引物的设计极其复杂，限制了其进一步应用。因此，建立恒温条件下的扩增技术受到极大关注，也成为当前miRNA检测技术发展的方向之一。

近期，一系列基于恒温靶序列循环的放大技术受到极大发展。李和徐提出利用核酸内切酶切割目标核酸/分子信标结合双链中的分子信标，不断释放目标核酸的靶序列循环方法。该方案能够显著放大信号,但由于核酸内切酶只能识别特殊序列，限制其应用于广泛的目标序列。随后，基于核酸外切酶的更通用的靶序列循环方法被提出。核酸外切酶III可以催化切割，并逐步消除单核苷酸3'羟基末端序列的双链。该方法在实现信号放大的同时克服了目标序列的限制。最近，基于核酸外切酶的二次酶放大技术(HQEA)被进一步提出。该方法显示了更高的信号放大能力，但由于核酸外切酶残余的活性会切割分子信标，引起高的背景信号，降低了信噪比。虽然可以通过将反应温度从37℃降低到4℃来抑制残余的外切酶活性，但分析时间必须从2小时延长到24小时。

发明内容

为了改善常规核酸分析中依赖PCR扩增技术导致的检测成本高，引物的设计复杂，测定假阳性率高的问题，解决现有恒温靶序列循环技术检测背景信号高，分析时间长的限制，实现高效、快速、高灵敏的核酸恒温分析目的。本工作通过设计一个特殊的颈环结构作为媒介体，触发聚合-链置换反应，形成靶序列循环，在短时间内扩增产生大量短链DNA片段，激活脱氧核酶(deoxyribozyme)，切割荧光底物，形成靶序列循环，恒温指数放大反应，以及脱氧核酶催化反应三重循环放大过程的串联，建立更为高效、快速的恒温指数放大技术，并应用于microRNA的超灵敏荧光检测。

本发明所采取的技术方案是：

一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大检测试剂盒，其包括：