[发明专利]利用噬菌体抗体库针对人组胺受体4（HR4）表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法

说明书

本发明公开了一种利用噬菌体抗体库针对人组胺受体4(HR4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法，利用噬菌体随机十二肽库筛选得到1条多肽片段，其氨基酸序列为：FNKWMDCLSVTH。本发明利用噬菌体随机十二肽库技术筛选HR4表位模拟肽的多肽序列，ELISA鉴定噬菌体单克隆对HR4单抗的亲和力，测序获得1条多肽序列，命名为PT1，进一步鉴定噬菌体阳性克隆的靶向性结果提示噬菌体阳性克隆能够特异性结合人HR4单克隆抗体，筛选获得的人HR4单克隆抗体特异性多肽，进而构建HR4表位模拟肽疫苗，本发明HR4模拟表位为基础的疫苗，将会在临床的变应性鼻炎治疗，及HR4拮抗剂的研制方面打下良好的基础，为其构建工作提供初步的实验依据。

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种用噬菌体抗体库针对人组胺受体4(HR4)表位模拟肽筛选及其疫苗构建方法。

背景技术

HR4分子及其拮抗剂的相关研究：1.HR4分子组胺受体-4(histamine receptor-4,HR4)是一种新发现的组胺受体，为跨膜G蛋白耦连受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)，功能在于抑制腺苷酰环化酶活性，活化磷酸蛋白酶C(phospholipase C)和诱导钙离子流动。HR4优先分布于免疫器官和造血细胞上，涉及到变应性鼻炎 (allergicrhinitis,AR)的病理性免疫应答的所有免疫细胞。肥大细胞、 CD4+T、CD8+T细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞都可以检测到HR4的表达，并被证明具有介导免疫调节功能。 2.HR4拮抗剂HR4拮抗剂对TLR配体诱导树突细胞的活化过程产生的IL-6、KC、MIP-α和IP-10等细胞因子和趋化因子表现为抑制作用，HR4的拮抗剂、负性激动剂已经在体外实验中获得了很好的抗炎前景。体外研究发现当HR4信号途径无作用的时候，在抗原刺激过程时，IFN-γ和特异性IgG2a均不增加,而且炎性细胞因子IL-6和 IL-17A也都表现为被抑制。这说明针对HR4信号途径的治疗在抑制 Th2细胞应答时，机体内的微环境并不向Th1类过度反应偏离，体内微环境处于相对稳定状态。JNJ-7777120是第一个，有效的，选择性非咪唑histamine H4receptor拮抗剂，Ki为4.5nM，比作用于其他组胺受体选择性高1000倍以上，其作用表现在嗜酸性粒细胞的趋化，肥大细胞的趋化以及变应性鼻炎及变应性气道炎症，并在变应性鼻炎皮炎动物模型获得良好的治疗作用。JNJ 7777120具有口服生物利用度，处理大鼠为30％，处理犬为100％，处理这两个品种的半衰期都为3小时。JNJ 7777120处理小鼠骨髓衍生的肥大细胞，抑制组胺诱导的趋化性和钙流入。JNJ 7777120处理小鼠，抑制组胺诱导的气管肥大细胞从结缔组织向上皮细胞的迁移。JNJ-7777120为化学合成，价格昂贵，3030RMB/50mg,存在口服生物利用度，对肝肾影响尚未明确。

噬菌体展示技术(Phage Display Technology)是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，1985年由美国Missouri大学G.P.Smith等首创，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子(如抗体、酶和细胞表面受体等)的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。噬菌体展示技术已被广泛用于肿瘤诊断标志物和抗肿瘤先导化合物的筛选、肿瘤特异性抗体和肿瘤药物靶向运输等方面的研究。

噬菌体展示技术正逐步发展成熟，为获取对癌症诊断和治疗有价值的多肽或抗体提供了重要手段。目前已发现多种与肿瘤相关的基因和抗原，肿瘤相关配体和多肽的筛选已成为寻找抗肿瘤药物的新热点，针对肿瘤细胞不同表达分子的特异性结合多肽，为肿瘤治疗提供了新的靶点，也为放射标记的肿瘤检测、化疗药物的给药、药物敏感实验及肿瘤的免疫治疗提供了新的分子靶位，噬菌体多肽还具有抑制肿瘤相关基因转录、阻碍肿瘤新生血管生成和转移及诱导肿瘤细胞凋亡等作用，将多肽与脂质体或纳米药物偶联，既有助于在达到更好的靶向治疗效果，又减小了药物的毒副作用，还可用于肿瘤血管三维成像和分子影像技术的检测及肿瘤治疗疗效评价。

发明内容