[发明专利]一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法

权利要求书

1.一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是：包括以下步骤：

(1)第一轮PCR反应：使用基因特异性引物组，用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框；

(2)第二轮PCR反应：使用一个通用引物组扩增，在第二轮PCR反应中5'端引入了噬菌体T7启动子，在3'端引入噬菌体T7终止子，步骤(1)得到的PCR产物经第二步PCR后引入组氨酸和T7噬菌体启动子和终止子片段；

(3)蛋白质合成：步骤(2)的PCR产物纯化后，添加大肠杆菌细胞提取物，并加入T7 RNA聚合酶，在30℃过夜，进行无细胞体外蛋白质合成反应；

(4)蛋白质纯化：组氨酸标记的蛋白是用镍涂覆的磁珠进行纯化。

2.根据权利要求1所述的新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是：所述的步骤(1)中采用基因特异性引物组包括引物1和引物2，引物1：5’端序列为若干个碱基加上16～18个碱基的基因特异性序列，引物2：3’端序列为与5’端相同数量个碱基加上16～18个碱基的基因特异性序列。

3.根据权利要求1所述的新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是：所述的步骤(2)中启动子片段序列：5'-GAT GCC GGC CAC GAT GCG TCC GGC GTA GAG GAT CGA GAT CTC GAT CCC GCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCC TCT AGA AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CCA TGC ATC ATC ATC ATC ATC AT-3'。

4.根据权利要求1所述的新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，其特征是：所述的步骤(2)中终止子片段序列：5'-GGC GAC CAC ACC CGT CCT GTG GAT ATC CGG ATA TAG TTC CTC CTT TCA GCA AAA AAC CCC TCA AGA CCC GTT TAG AGG CCC CAA GGG GTT ATG CTA GTT ATT GCT CAG CGG TGG CAG CAG CCA ACT CAG CTT CCT TTC GGG CTT TGT TAG CAG CCG GAT TA-3'。