[发明专利]一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法。

背景技术

噬菌体T7编码其自身的RNA聚合酶，该RNA聚合酶是相对简单和高效。它可以和23个bp核苷酸启动子序列结合启动转录，这个序列在大肠杆菌基因组中不存在。转录非常的迅速有效，转录速度是大肠杆菌RNA聚合酶的五倍。

这些性质使T7RNA聚合酶和它的启动子系统被用于控制在大肠杆菌和其它生物中的外源基因的表达。为了表达重组蛋白质，PCR然后克隆是必需的。克隆需要时间,而且许多的毒性基因不能在体内被克隆，不能以高通量的方式地完成。

本发明开发出一种方法，将T7启动子和终止子添加到目标基因片来体外表达蛋白。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：基于上述问题，本发明提供一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法。

本发明解决其技术问题所采用的一个技术方案是：一种新型利用聚合酶链反应体外表达蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)第一轮PCR反应：使用基因特异性引物组，用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框；

(2)第二轮PCR反应：使用一个通用引物组扩增，第二轮PCR反应在5'端引入了噬菌体T7启动子，在3'端引入噬菌体T7终止子，步骤(1)得到的PCR产物等分试样被转移到含有T7组氨酸启动子片段和T7终止子片段中；

(3)蛋白质合成：步骤(2)的PCR产物纯化后，添加体外大肠杆菌细胞提取物，并加入T7RNA聚合酶，蛋白质合成反应在30℃过夜；

(4)蛋白质纯化：组氨酸标记的蛋白是用镍涂覆的磁珠进行纯化。

进一步地，步骤(1)中基因特异性引物组包括引物1和引物2，引物1：5’端序列为若干个碱基加上16～18个碱基的基因特异性序列，引物2：3’端序列为与5’端相同数量个碱基加上16～18个碱基的基因特异性序列。

进一步地，步骤(2)中启动子片段序列：5'-GAT GCC GGC CAC GAT GCG TCC GGC GTA GAG GAT CGA GAT CTC GAT CCC GCG AAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA CCA CAA CGG TTT CCC TCT AGA AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CCA TGC ATC ATC ATC ATC ATC AT-3'。

进一步地，步骤(2)中终止子片段序列：5'-GGC GAC CAC ACC CGT CCT GTG GAT ATC CGG ATA TAG TTC CTC CTT TCA GCA AAA AAC CCC TCA AGA CCC GTT TAG AGG CCC CAA GGG GTT ATG CTA GTT ATT GCT CAG CGG TGG CAG CAG CCA ACT CAG CTT CCT TTC GGG CTT TGT TAG CAG CCG GAT TA-3'。

本发明的有益效果是：通过PCR给基因增加T7启动子和T7终止子，使其成为蛋白质的表达片段。该蛋白表达片段可被加入到大肠杆菌或其他细菌细胞提取物进行体外蛋白质表达；该方法高速、可高通量表达体外重组蛋白，尤其适合有毒蛋白。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

图1是本发明的流程图。

具体实施方式

现在结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例

生成组氨酸标记的多肽蛋白片段，建立多肽库以便用于抗原筛选。所有结核杆菌蛋白质均使用上述体外表达方法制备。

(1)第一轮PCR反应：结核分支杆菌基因特异性引物组用PCR扩增每一个潜在的开放阅读框。引物1：如5’端序列：ACCATGCATCATCATCATCATCAT这24个碱基加上16～18个碱基的基因特异性序列。引物1：3’端序列：CGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATTA这24个碱基加上16～18个碱基的基因特异性序列。

制备DNA：根据TaKaRa PCR kit复制结核杆菌的开放阅读框。取genomic DNA20～50ug进行PCR反应，PCR反应体系：10×缓冲液2.5μl，10mmol/L dNTP 0.25μl，5U/μl Taq DNA。