[发明专利]水稻鞘脂的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物鞘脂领域，具体涉及一种水稻鞘脂的检测方法。

背景技术

鞘脂是脂类的一种，是一类含有鞘氨醇骨架的两性脂，其具有一个极性头基和两个非极性尾(脂肪酸和鞘氨醇的长烃链)，属极性脂类，是仅次于磷脂的第二大类膜脂。鞘脂包括鞘磷脂(sphingomyelin)、脑苷脂(cerebroside)以及神经节苷脂(ganglioside)，脑苷脂和神经节苷脂这样的含糖脂质也可归于糖脂一类，称鞘糖脂，它存在于所有的动物、植物、真菌、少数原核生物和病毒中。在真核生物中大约有300-400种不同种类具生物活性的鞘脂分子，且不同的生物中含有的鞘脂种类及含量是不同的，一般存在三种鞘氨基醇，即鞘氨醇、二氢鞘氨醇和植物鞘氨醇。鞘氨醇是哺乳动物细胞中主要的鞘氨基醇类物质，其次是二氢鞘氨醇，然而，在植物和真菌中植物鞘氨醇(4-hydroxysphinganine,t18:0，phytosphingosine)是主要的鞘氨基醇类物质。哺乳动物中的鞘脂主要是鞘磷脂；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的鞘脂主要是肌醇磷酸神经酰胺(inositolphosphorylceramides，IPCs)，其他真菌中还含有葡糖神经酰胺(glucosylceramide，GlcCer)；而在植物中含量最多的是糖基肌醇磷酸神经酰胺(glycosyl inositol phosphoceramides，GIPCs)，且GIPCs不存在于哺乳动物中。

由于植物鞘脂在植物中含量很少，而且缺乏好的植物鞘脂的分析方法，一直以来植物鞘脂的研究进展缓慢。优化鞘脂的提取与检测方法能提高植物鞘脂的检测水平，进而能更细致地观察到鞘脂在植物的生长发育以及抵抗逆境中的变化，从而进一步揭示鞘脂是如何参与到这些重要的生理生化过程。

水稻(Oryza sativa L.)是极为重要的粮食作物，特别是我国是人口大国，解决不断增长人口的粮食问题一直是国家工作的重点问题，对水稻的生长发育、产量及病虫害抗性相关基因的研究，具有重要的理论和实际意义。水稻是单子叶植物研究的模式植物。研究显示，植物中的鞘脂代谢途径与植物的抗病性密切相关。因此可通过检测水稻内源的鞘脂水平来促进与加快水稻鞘脂功能的研究，对于水稻育种及性状的遗传改良具有重要的理论与应用价值。

然而，现有技术中尚未出现有效的检测水稻鞘脂的方法。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种准确、灵敏、精确的水稻鞘脂的检测方法。

为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

一种水稻鞘脂的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)加入1ml流动相B至氮气吹干的样品，振荡1分钟，超声1分钟；

(2)用0.22微米的尼龙膜过滤样品溶液；

(3)取200μl的样品溶液至色谱进样瓶；

(4)用高效液相与质谱联用技术对水稻鞘脂进行分析。

其中，流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合物，甲酸的体积百分浓度为0.2％，甲酸铵的浓度为2mM，其余为甲醇。

优选地，使用的色谱柱为Phenomenex Luna C8，2.1×150mm 3μ column。

优选地，液相梯度洗脱条件为：0～3分钟，80％流动相B；3～13分钟，80％～90％流动相B；13～25分钟，90％～99％流动相B；25～25.10分钟，99％～80％流动相B；25.10～32分钟，80％流动相B；

优选地，液相条件为：流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合物，甲酸的体积百分浓度为0.2％，甲酸铵的浓度为2mM，其余为水；流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合物，甲酸的体积百分浓度为0.2％，甲酸铵的浓度为2mM，其余为甲醇；流速为300μL/min，柱温为40℃；进样量为10μL。

优选地，质谱的参数设置为：雾化气：60psi；辅助气：50psi；气帘气：30psi；离子源温度：450℃；电压：5000V。

优选地，本发明使用的质谱系统为AB SCIEX5600+质谱系统。

优选地，所述水稻鞘脂通过以下步骤提取获得：

(1)称取0.5克水稻叶片，液氮研磨至粉末，加入4ml提取液和100μl内标溶液，振荡混匀；所述提取液为体积比为2：1的甲醇和氯仿的混合物；所述内标溶液含C17鞘氨醇、C12神经酰胺、C12葡萄糖神经酰胺，浓度均为1μM；

(2)超声振荡5分钟，随后45℃水浴放置10分钟，离心后取上清；