[发明专利]一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明属于生物学分子标记领域，涉及一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物。

背景技术

芽变，是植物体细胞内遗传物质发生改变，这种改变往往发生在芽的分生组织细胞中，当芽萌发成新植株时，即表现出新个体与原类型在性状上有所不同。所以，芽变为植物新品种选育提供了一条重要途径。

果蔗在我国具有悠久的种植历史，分布范围也较广。目前我国生产上使用的果蔗品种可分为二大类，一是果蔗专用型品种，二是果糖兼用型品种。其中拔地拉栽培面积最大，以我国果蔗栽培面积最大的广西为列，拔地拉种植面积占果蔗种植总面积的90％以上，地方果蔗品种如青皮蔗、白皮蔗、黄皮果蔗、福建蜡蔗等的种植面积占不到总面积的10％。拔地拉原产热带地区，对水温肥等条件要求较高，在生长过程中对环境条件比较敏感，其主要表现是常因水肥管理偏差导致生长受抑制而出现短节现象，严重影响其商品性。为克服此问题，目前在栽培管理过程中，蔗农通过施用大量水肥及植物生长调节剂，使得果蔗节间长度达到一定长度，从而提高拔地拉的商品性。

目前果蔗新品种选育主要是利用糖蔗品种作为亲本进行常规杂交选育，并育成了一批果糖兼用品种，但品质低于拔地拉。发明人经研究发现，将新型SCoT(Start codon targeted polymorphism)标记技术应用到果蔗拔地拉及其芽变类型的分子鉴定中，虽然PCR扩增效果非常好，但所用引物难以检测到遗传差异，不能对果蔗拔地拉及其芽变类型进行分子鉴定，如图1所示。

因此，鉴于中国果蔗品种现状及存在问题，从果蔗自然突变株中系统选育果蔗新品种，以期育成高产、稳产、优质、抗病、适应性广、应用前景好的果蔗新品种，是果蔗生产的当务之急。

发明内容

针对以上技术问题，本发明的目的是提供一种果蔗芽变的分子鉴定方法及其专用引物，以便从果蔗拔地拉自然突变株中有效、快速的鉴定出果蔗芽变品种。

对此，本发明的技术方案为：

一种果蔗芽变的分子鉴定的专用引物，所述专用引物为序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列的引物，所述专用引物为URP(Universal Rice Primer)标记单引物。

所述专用引物的核苷酸序列为：

URP38F：AAGAGGCATTCTACCACCAC。

所述专用引物以下统称为URP38F。

一种果蔗芽变的分子鉴定方法，包括以下步骤：提取果蔗亲本拔地拉及对应的疑似芽变果蔗品种的基因组DNA，用所述专用引物即URP38F分别对基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以区分亲本拔地拉及其对应的疑似芽变果蔗品种，果蔗亲本拔地拉与其对应的疑似芽变果蔗之间的电泳条带模式在625bp处有强度差异，疑似芽变果蔗品种为真实芽变品种。

作为本发明的进一步地改进，所述PCR扩增的程序是：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1.5min，其中，变性、退火、延伸三个步骤循环35次；72℃最后一步延伸10min，10℃保存。

作为本发明的进一步地改进，所述PCR扩增体系为20ul，包括：10×PCR含Mg²⁺的Buffer 2.0ul，2.5mM的dNTP 0.5ul，10pmol/ul的URP38F 1ul，2.5U/ul的Taq酶0.5ul，50ng/ul的DNA模板1.0ul，ddH₂O补足。

作为本发明的进一步地改进，所述果蔗的基因组DNA从果蔗植株的嫩叶中提取。

作为本发明的进一步地改进，所述提取果蔗基因组DNA的方法，包括以下步骤：

步骤A：取新鲜果蔗嫩叶，放入研钵中并在研钵中加入PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，加入液氮，将叶片充分研磨成粉末状样品；

步骤B：将所述粉末状样品转移到装有预热的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液的离心管中，并加入β-巯基乙醇，于65℃水浴锅中温浴60min，混匀；

步骤C：将步骤B的离心管置于4℃冷冻离心机中，12000rpm离心10min后，吸取上清液，并在上清液中加入RNaseA(核糖核酸酶A)，混匀，静置5min；

步骤D：加入与步骤C所述的上清液等体积的氯仿，抽提，混匀，静置5min，冷冻离心机中12000rpm离心10min；

步骤E：再次吸取上清液，并再次加入等体积的氯仿抽提，于冷冻离心机中12000rpm离心10min；