[发明专利]一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法

权利要求书

1.一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将地衣芽孢杆菌菌液接种于pH＝6.4-7.5的液体培养基中，在35-40℃、160-280rpm条件下培养10-18h，进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将所述活化种子液按2-7％的接种量接种于装有pH＝6.4-7.5的新鲜液体培养基的锥形瓶中，在35-40℃、160-280rpm条件下培养2-6h，得到地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将所述地衣芽孢杆菌培养物于4℃、3000-8000rpm转速下离心10-40min，去除上清液，获得沉淀菌体；

按体积比1：4-8向所述沉淀菌体中加入无菌水、振荡混均，再于4℃、3000-8000rpm转速下离心10-40min，去除上清液，反复洗涤2-3次，最后用无菌水悬浮菌体，得到活菌数≥10⁹cfu/mL的地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将所述地衣芽孢杆菌菌悬液加入到经无菌处理的聚阴离子电解质溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液，在所述内水相菌体悬浮液中聚阴离子电解质浓度为0.01-0.04g/mL；所述的聚阴离子电解质溶液为海藻酸钠溶液；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经无菌处理的浓度为0.04-0.1g/mL的小分子溶液作为外水相A液备用；配制经无菌处理的浓度为0.005-0.03g/mL的聚阳离子电解质溶液作为外水相B液备用；所述的聚阳离子电解质溶液为氯化壳聚糖溶液；

(6)地衣芽孢杆菌湿微胶囊的制备：将1-5mL的内水相菌体悬浮液以450-850μL·min^-1的流速注入到15-60mL外水相A液中，在200-500rpm转速下保持外水相的低速流动，经室温固化反应5-35min后，收集载菌微胶囊，用无菌水洗涤后缓慢加入到15-60mL外水相B液中，在200-500rpm转速下保持外水相的低速流动，室温包衣反应5-35min后，收集产物并用无菌水均匀洗涤，得到耐胃酸型地衣芽孢杆菌湿微胶囊；

(7)干燥保藏：将所述耐胃酸型地衣芽孢杆菌湿微胶囊低温真空干燥后，在无菌条件下进行真空包装，即得到干燥的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊。

2.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：

步骤(7)中所述的低温真空干燥为45℃以下的任何一种干燥方式。

3.根据权利要求1所述地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的地衣芽孢杆菌菌株为野生型地衣芽胞杆菌、基因工程型地衣芽胞杆菌中的一种或两种。

4.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述的液体培养基为MRS液体培养基、LB液体培养基或大豆豆粕上清液体培养基。

5.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(4)和步 骤(5)中所述的无菌处理方法为过滤除菌或高温灭菌。

6.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的小分子溶液为氯化钙溶液、氯化钡溶液或氯化铁溶液。

7.根据权利要求1所述地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于：步骤(3)和步骤(6)中所述的无菌水为蒸馏水、生理盐水或磷酸盐缓冲液。