[发明专利]一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及益生菌微胶囊制备技术领域，具体地说是一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法。

背景技术

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种芽孢杆菌科细菌，为革兰氏阳性杆菌。地衣芽孢杆菌能够调节肠道内微生物菌群之间、微生物菌群与宿主之间的微生态平衡。肠道微生态功能紊乱所导致的疾病，如细菌或病毒性腹泻、急慢性肠炎，可以通过服用地衣芽孢杆菌制剂来调整肠道菌群失调，达到治疗并恢复肠道功能的目的；同时，地衣芽孢杆菌可促使机体产生抗菌活性物质，以杀灭致病菌。此外，地衣芽孢杆菌在机体内能产生抗活性物质，具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。故地衣芽胞杆菌在临床医学上属于安全性的有益微生物，在保健食品中属于益生菌。

益生菌是指定植于人体生殖系统和肠道内，能产生确切健康功效以改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性微生物的总称。益生菌能够产生多种健康功效，如可以改善产品风味、降低胆固醇浓度、调节并维持肠道微生态平衡、抗癌抗肿瘤效应、提高乳糖利用率，因而益生菌在保健和医疗等领域具有较大的应用开发潜力。然而，益生菌制剂在生产、保藏及给药过程中，会受到一系列因素的影响，外界因素如温度、湿度等，体内因素如胃酸、消化酶类等，导致到达肠道部位的活菌数量大大减少，限制了益生菌功效的发挥。因此，将益生菌包埋在合适的载体中，如微胶囊内，可以降低不良因素的影响，从而提高益生菌肠道定植的存活率。

自然界中的天然多糖类高分子及其衍生物，具有良好的生物学性能如无毒、亲水溶胀性、生物相容性、生物可降解性；同时，具有聚电解质特性，即溶于水后能产生聚阳离子或聚阴离子基团，因而是制备聚合电解质微胶囊的优选材料。天然多糖类高分子，如氯化壳聚糖，其具备壳聚糖的优良特性，且能够直接溶于水(中性pH环境中)；同时，作为聚阳离子电解质，氯化壳聚糖能够与聚阴离子电解质反应形成聚合电解质复合物薄膜。常用的聚阴离子电解质，如海藻酸钠、纤维素硫酸钠，皆具有可成膜性、生物相容性、生物可降解性等优良性能。通过带有相反电荷的多糖类聚电解质之间、或聚电解质与小分子交联剂之间的相互反应，形成聚合电解质膜用以设计益生菌微载体，如壳聚糖-海藻酸微胶囊、海藻酸钙凝胶微球等，已有较多的研究报道，但依然存在很多不足，如：耐胃酸性能差、存活率低。克服此类问题的主要途径：一是提高益生菌菌株的抗逆性；二是选择合适的载体材料以提高载菌微胶囊的环境耐受性。

发明内容

本发明公开一种具有高存活率的耐胃酸型地衣芽胞杆菌微胶囊的制备方法，旨在提高地衣芽胞杆菌的抗逆性、环境耐受性，大幅提高活菌通过胃部后的存活率，在载体保护下使大量活菌在肠道部位释放并定植，达到益生保健功效。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

本发明具有高存活率的耐胃酸型地衣芽孢杆菌微胶囊的制备方法，其特点在于，包括以下步骤：

(1)菌株活化：将地衣芽孢杆菌菌液接种于pH＝6.4-7.5的液体培养基中，在35-40℃、160-280rpm条件下培养10-18h，进行菌种活化，得到活化种子液；

(2)扩大培养：将所述活化种子液按2-7％的接种量接种于装有pH＝6.4-7.5的新鲜液体培养基的锥形瓶中，在35-40℃、160-280rpm条件下培养2-6h，得到地衣芽孢杆菌培养物；

(3)菌悬液制备：将所述地衣芽孢杆菌培养物于4℃、3000-8000rpm转速下离心10-40min，去除上清液，获得沉淀菌体；

按体积比1：4-8向所述沉淀菌体中加入无菌水、振荡混均，再于4℃、3000-8000rpm转速下离心10-40min，去除上清液，反复洗涤2-3次，最后用无菌水悬浮菌体，得到活菌数≥10⁹cfu/mL的地衣芽孢杆菌菌悬液；

(4)内水相菌体悬浮液制备：将所述地衣芽孢杆菌菌悬液加入到经无菌处理的聚阴离子电解质溶液中，无菌条件下振荡混均，得到内水相菌体悬浮液，在所述内水相菌体悬浮液中聚阴离子电解质浓度为0.01-0.04g/mL；

(5)外水相A液、外水相B液制备：配制经无菌处理的浓度为0.04-0.1g/mL的小分子溶液作为外水相A液备用；配制经无菌处理的浓度为0.005-0.03g/mL的聚阳离子电解质溶液作为外水相B液备用；