[发明专利]伪狂犬病病毒LA‑A株、构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物医学的疫苗领域，具体涉及伪狂犬病病毒LA-A株、构建方法及其应用。

背景技术

伪狂犬病又被称为Aujesky病，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV，又称为猪疱疹病毒1型)引起的一种急性、烈性传染病，感染牛、羊等家畜和野生动物，常表现为发热、奇痒、脑脊髓炎等临床症状。发病猪只常出现体温升高，母猪常发生流产，新生仔猪有神经症状，育肥猪主要是呼吸道症状，成年猪感染伪狂犬病毒后生长停滞，对养猪业危害极大。上世纪80年代到2010年期间，由于PRV gE缺失株疫苗(如Bartha K61株等)的大规模推广使用，并配合检测gE和gB抗体进行免疫猪只与野毒感染猪只的鉴别诊断，通过持续淘汰阳性种猪的方法，我国许多猪场成功建立了PRV阴性的猪群，许多猪场基本实现了PRV的净化，猪伪狂犬病得到了较好控制。一些发达国家宣布在家养猪群中已全面实现PRV的净化，停止接种猪伪狂犬病疫苗。然而，自2011年以来，河南、河北等多地免疫过PRV Bartha K61株疫苗的猪场大规模出现猪伪狂犬病疫情，之后疫情逐步向全国大部分养猪场蔓延。初步研究结果表明从免疫过PRV Bartha K61疫苗猪场的死亡仔猪分离获得的PRV野毒株的致病性显著增强，因此研制出一种新的针对目前伪狂犬变异株的疫苗是极为迫切的。

发明内容

本发明的目的是提供伪狂犬病病毒LA-A株，能够很好的适应BHK-21细胞，生长滴度高达10^9.5TCID₅₀/mL。

本发明的另一目的是提供简单、高效的伪狂犬病病毒株LA-A株的构建方法。

本发明的再一目的是提供以伪狂犬病病毒LA-A株为活性成分的疫苗。采用伪狂犬病病毒LA-A株的疫苗能达到对伪狂犬病病毒变异株100％保护效果，尤其是该疫苗不但能阻止发病，还能阻止排毒，取得了意想不到的技术效果。通过对抗体进行监测，可以区分免疫该疫苗的动物与感染动物，有利于对PRV变异株的净化。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

伪狂犬病病毒株LA-A株，是敲除伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因后获得的，所述伪狂犬病病毒AH02LA株的保藏登记号为：CGMCC No.10891。

在本发明中，所述伪狂犬病病毒LA-A株gB基因的序列如SEQ ID No:1所示、gC基因的序列如SEQ ID No:2所示、gD基因的序列如SEQ ID No:3所示。

优选的技术方案中所述伪狂犬病病毒株LA-A株，是敲除伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因第1～1418位核苷酸后获得的，所述gE基因的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

本发明还要求保护所述伪狂犬病病毒株LA-A株的构建方法，包括如下步骤：

(1)分别扩增伪狂犬病病毒AH02LA株gE基因上游同源臂和下游同源臂；将表达绿色荧光蛋白的表达盒插入上游同源臂和下游同源臂之间，得到同源重组片段A；将上游同源臂和下游同源臂直接连接，得到同源重组片段B；

(2)伪狂犬病病毒AH02LA株的DNA与同源重组片段A进行同源重组，挑选在紫外光下发出绿色荧光的重组病毒，获得重组病毒C；

(3)重组病毒C的DNA与同源重组片段B的DNA进行同源重组，挑选在紫外光下不能发出绿色荧光的重组病毒，得到所述伪狂犬病病毒株LA-A株。

本发明还要求保护以所述伪狂犬病病毒LA-A株为活性成分的疫苗。

优选的技术方案中，所述伪狂犬病病毒LA-A株采用如下方法进行培养：将伪狂犬病病毒LA-A株接种BHK-21细胞，采用含有胎牛血清的DMEM培养基培养36～48小时，收获病毒培养物，冻融后离心取上清液作为伪狂犬病病毒LA-A株病毒液。

优选的技术方案中，所述疫苗为灭活疫苗或活疫苗。

优选的技术方案中，所述灭活疫苗为油乳剂或双相复乳，伪狂犬病病毒株LA-A株采用甲醛或β-丙内酯灭活。

本发伪狂犬病病毒株LA-A株可以作为载体构建载体活疫苗，外源基因的插入位点包括基因组的UL51与UL50之间、UL46与UL27之间、UL35与UL36之间、UL40与UL41之间、UL44与UL26.5之间、UL22与UL21之间和UL4与UL3.5之间的非编码区，启动子可以选择pHCMV IE、pMCMV IE和SV40等，插入的外源基因包括狂犬病病毒的G蛋白基因、猪瘟病毒的E蛋白基因、口蹄疫病毒的VP1基因、猪流感病毒的HA基因、猪圆环病毒的Cap蛋白基因和兔瘟病毒的VP60基因等。