[发明专利]一种固载甲基转移酶电极传感器的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种酶电极传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种固载甲基转移酶电极传感器的制备方法，用于检测药品、生物样品中的S-腺苷甲硫氨酸技术。

背景技术

酶电极分析方法是将酶蛋白分子采用传统的吸附法、包埋法、共价键合法、交联法作用固定化制成固定化酶膜，再与电化学基础电极相结合，构成酶电极生物传感器用于特异底物分析的一项生物技术。由于酶的高度专一性，该方法具有专一性高、稳定性好、检测速度快、选择性好、灵敏度高等特点。酶电极研究起步于20世纪60年代，自2000年以来，生物传感器技术在环境检测、食品安全、军事和医学等方面的应用日益广泛，在申请号为201410210210.3的专利中公开了检测对苯二酚和邻苯二酚的共固定酶电极制备方法及应用；在授权公告号为CN102435650 B的专利中公开了一种酶电极的制备及快速检测植物油过氧化值的方法；在授权公告号为CN102495115 B的专利中公开了利用生物酶电极法检测根系分泌物中苹果酸的电化学方法。

细胞内的甲基化反应存在通用甲基供体—S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine，AdoMet，SAM），SAM含有活性甲基，细胞内几乎所有用于甲基化修饰的甲基都来自SAM甲硫高能键。由于甲基化反应的广泛性，可以说，SAM是细胞内参加反应的重要性仅次于ATP的一种辅酶，细胞内SAM浓度的微小改变，便会对细胞的生长、分化和功能产生重大影响。SAM在细菌体内主要是由SAM合成酶（MetK）通过甲硫氨酸(Met)和ATP来合成。当E.coli的SAM合成酶水平下降，造成细胞内甲基供体SAM缺乏时，细胞就不会正常分裂。如果将来自T3噬菌体的AdoMet水解酶基因导入E.coli菌体细胞，使胞内SAM水平下降时，大肠埃希氏菌也形成了不分裂的长丝状菌体。进一步研究表明，丝状菌体中，引发E.coli细胞分裂的Z环复合体装配可以正常起始，但不会完成，而当亮氨酸调节的SAM合成酶水平恢复正常，细胞内甲基供体SAM不再缺乏时，细胞分裂也随即恢复正常。很明显，细菌细胞的生长分裂与胞内SAM浓度是密切相关的。

通用甲基供体SAM受甲基转移酶催化去甲基后，生成的通用产物是S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocystein，SAH），SAH被发现对胞内蛋白质和核酸的甲基化过程具有普遍的反馈抑制作用，是转甲基化反应的有效竞争性抑制剂。在哺乳动物细胞内，SAH通过SAH水解酶（SAH hydrolase，SAHH）催化水解生成腺苷酸和高半胱氨酸（Parveen, N.; Cornell, K. A.. Methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase, a critical enzyme for bacterial metabolism. Mol Microbiol, 20117，9(1)：7-20,），而在大多数病原微生物的细胞内，SAH的代谢则采用完全不同的方式——通过S-腺苷高半胱氨酸核苷酶（S-adenosylhomocystein nucleosidase，SAHN）催化裂解生成腺嘌呤和S-核糖基高半胱氨酸，SRH进一步在S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的作用下生成高半胱氨酸和4,5二羟-2,3-乙酰基丙酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD），高半胱氨酸最后通过几种甲硫氨酸合成酶（MetH、MetE）重新生成SAM的前体——甲硫氨酸，或者经过多步酶催化生成半胱氨酸。

目前，已报道的测定SAM的方法有高效液相色谱法（HPLC），该方法存在色谱柱容易污染，分析价格昂贵的缺陷，分光光度法，谷劲松等研究S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲级转移酶活性的检测方法 (谷劲松等，一种S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲级转移酶活性的检测方法，高等学校化学学报，2012，33（3）：521~525)，该方法是依赖甲基转移酶、S-腺苷高半胱氨酸核苷酶和S-核糖基高半胱氨酸酶的催化作用将SAM分解为高半胱氨酸，再对高半胱氨酸显色反应，操作比较繁琐，准确度也不理想。由于样品的基质比较复杂，给检测带来了困难。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对研究人员、生产企业、质控人员、进出口商检、政府管理部门等的迫切需要的，对食品、药品、环境安全、生物样品中的SAM含量准确定量测定十分必要，对于SAM生产和药理研究也具有十分重要的意义。