[发明专利]变形链球菌细胞表面蛋白抗原(SpaP)和葡糖基转移酶(GtfB)融合蛋白疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种变形链球菌细胞表面蛋白抗原SpaP和葡糖基转移酶GtfB融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.权利要求1所述的融合蛋白在制备防龋齿亚单位疫苗中的应用。

3.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其主要包含步骤：

1)引物的设计合成

从NCBI:BLAST中的变形链球菌UA159(streptococcus mutans UA159)基因组序列中表面蛋白SpaP序列(Genbank Gene ID:102805)，以及β-1,3-葡聚糖酶GtfB编码序列(GeneID:1028336)，设计合成二对特异性引物，引物的序列和编号如下:

(1)GtfB基因PCR扩增引物

上游引物P1(SEQ ID NO.2)

5′-CGCGGATCCATGGGCTATCAAGCCAAAG-3′

下游引物P2(SEQ ID NO.3)

5′-CCGCTCGAGAATCCGAACTCGTTCTCCAG-3′

(2)SpaP-(G4S)3基因PCR扩增引物

上游引物P3(SEQ ID NO.4)

5′-CTAGCTAGCATGACCAATGCTGCCAATC-3′

下游引物P4(SEQ ID NO.5)

5′-CGCGGATCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCGCTTCCTCCTCCTCCCTCTGCTTCATAGCTTGGC-3′

2)将所述GtfB基因片段、SpaP-(G4S)3基因片段分别构建到含有6-His组氨酸标签的表达载体pET28a质粒上，得到重组质粒，转化至表达菌E.coli DH5α，酶切鉴定；

3)诱导表达可溶性的重组蛋白：挑取含有目的蛋白的重组子的单克隆，转入卡那霉素阳性的LB液体培养基，37℃过夜震荡培养；再接种至新鲜配制的卡那霉素阳性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡过夜，增菌，待A600 OD值为0.5-0.6时，加入IPTG终浓度为1.0mmol/L，37℃继续培养4小时；

4)纯化步骤3获得的重组蛋白，4℃，8000rpm离心5分钟收集诱导后的菌体，去上清，用binding buffer洗涤一次，根据菌体的量，选择适量的binding buffer重悬菌体；冰浴环境下，超声破碎，收集蛋白粗液；10000rpm，30min，4℃离心破碎液，收集上清，并经0.45μm过滤器过滤，冰浴备用；使用1ml HisTrap FF镍柱以及AKTA purifier 10仪器进行纯化，SDS-PAGE电泳，分析目的蛋白的纯度；冰浴搅拌透析换液，除去咪唑。