[发明专利]变形链球菌细胞表面蛋白抗原(SpaP)和葡糖基转移酶(GtfB)融合蛋白疫苗及其制备方法

说明书

本发明涉及一种变形链球菌表面蛋白抗原SpaP与葡糖基转移酶GtfB融合蛋白及制备方法和应用，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。本发明将变形链球菌表面蛋白抗原SpaP基因与葡糖基转移酶GtfB基因通过Lingker序列连接获得融合蛋白，用于制备防龋齿蛋白疫苗。该基因工程亚单位疫苗免疫原性良好，可以高效的引起接种体的免疫应答。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种变形链球菌细胞表面蛋白抗原(SpaP)和葡糖基转移酶(GtfB)融合蛋白疫苗及其制备方法。

背景技术

龋齿、心血管疾病和癌症并称为人类三大疾病。在中国，80％的儿童、50％的成人、98％的老年人都不同程度受其困扰。要达到龋齿的有效预防，除了降低碳水化合物摄入、利用氟化物增强牙齿对酸的抵抗力和采用密封剂减少致病菌在齿沟的定植之外，使用抗菌物质减少或者消灭致龋微生物是科学家数十年来研究的重点，龋齿疫苗的研发更是重中之重，但到目前为止，仍然没有一种疫苗能够在临床应用。

龋齿疫苗的研发是随着对致龋微生物的逐渐认识而进行的，变形链球菌是主要的致龋微生物，其致龋性主要表现在对牙面的黏附、产酸、耐酸以及产生多糖和细菌素等方面，针对变形链球菌的疫苗种类较多。早期，科学家们尝试将完整的变形链球菌灭活，作为经口途径的疫苗使用，但是因为变形链球菌有能与心肌特别是心脂质和肌纤维膜鞘交叉反应的抗原，导致接种者死亡的潜在危险而不被接受。随后，DNA重组技术被用来将致龋微生物的抗原成分重组到非致龋、无交叉反应的良性细菌(如乳酸杆菌等)中，但是没有足够证据能够保证所谓的良性细菌足够安全。同时，DNA疫苗的研究也受到广泛重视，也因为人们对其生物安全性的担心而迟迟不能在临床上应用。本课题组在防龋DNA疫苗方面进行了系列研究，开发3代防龋DNA疫苗，已经进入中试阶段，但是DNA疫苗应用于临床尚存在诸多障碍，因安全上的顾虑，目前尚无任何一种DNA疫苗被批准应用。

近来，由于蛋白质亚单位和多肽疫苗不含有核酸，其安全性理论上比DNA疫苗高，多种蛋白类疫苗已经成功应用于临床(如乙肝疫苗等)。80年代人们随着对变链菌细胞壁各种抗原性多聚物的逐渐认识，免疫防龋转入以变链菌单一抗原成分制备亚单位防龋疫苗的研究。研究的焦点集中于两种候选疫苗，即变链菌主要表面蛋白抗原SpaP和葡糖基转移酶GtfB，它们在介导变链菌对牙面的粘附和定殖过程中起着重要作用。近10年的大量研究证实，用SpaP和GtfB主动免疫能明显抑制实验动物和自愿受试者牙面变链菌的粘附和龋病发生率，且纯化的抗原不会介导心脏交叉反应。变异链球菌表面蛋白抗原(SpaP)又被称为蛋白P1(protein P1)、抗原Ⅰ/Ⅱ(antigen Ⅰ/Ⅱ,Ag Ⅰ/Ⅱ)等，是一种存在于细胞壁的大分子表面糖蛋白，也是变异链球菌菌体胞壁上主要的黏结蛋白之一，在细菌对牙面的初始黏附(非蔗糖依赖性黏附)和促进菌体之间的聚集过程中发挥重要的介导作用，是致龋变异链球菌的重要毒力因子之一。GtfB已被证实是防龋疫苗重要的有效抗原，它包含两个功能区：氨基端催化活性区CAT和羧基端葡聚糖结合区GLU。目前已经在变形链球菌的表面抗原(SpaP)和GtfB(GlU区)多肽疫苗的研发方面取得了初步的结果，发现这两种蛋白多肽疫苗都能提供一定的防龋齿保护效果，但是如何进一步提高其免疫效果，是一大挑战。

发明内容

本发明涉及一种将变形链球菌SpaP和GtfB通过柔性连接，构建了同时包含SpaP和GtfB的融合蛋白，增强了黏膜免疫的效能，更加有效的预防龋齿的发生。柔性接头linker(G4S)3主要是利用gly和ser空间柔性使融合的两个蛋白在空间上能自由伸展，不造成活性位点的相互掩盖。以期能够得到更容易表达的结构正确的融合蛋白。

本发明一个方面涉及一种融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

本发明的另一个目的是提供以上融合蛋白的制备方法，其主要包含步骤：

1)引物的设计合成