[发明专利]一种用于检测梨黑斑病菌的引物及利用其检测梨黑斑病菌的检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测梨黑斑病菌的引物，包括一对引物，其上游引物序列如HB1所述，下游引物序列如HB2所述,其中，HB1为：TCACCCTTGTCTTTTGCGTA，HB2为：ACCTTTGCTGATAGAGAGTG。及利用该引物检测梨黑斑病菌的方法。本发明通过设计一对特异性引物，结合PCR扩增的方法可以有效地检测植物组织中的梨黑斑病菌。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可参考应用于田间调查和植物产品的检验，对控制梨黑斑病的大面积爆发和跨区域传播具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。

技术领域

本发明涉及一种用于检测梨黑斑病菌的引物，以及利用所述引物检测梨黑斑病菌的分子检测方法。

背景技术

梨黑斑病病菌（Alternaria alternata）主要危害叶，果实和新梢，导致树体衰弱，并引起贮藏期果实发病，造成重大经济损失。该病害在日本，法国,韩国等均有报道，在我国多个省份均有发生，严重影响我国梨产业的发展。但采用传统的植物病害检测方法直接观察，会遗漏发病初期未表现出症状的情况，且依赖形态学的检测方法易受到人为因素和环境条件的干扰，加之传统的分类方法耗时长，程序繁琐，不适合快速检测的要求，很难实现对病害发生的及时监测和有效控制病原菌的传播和病害流行。随着分子生物学技术的发展，采用分子检测方法为该病害的诊断提供了很好的检测手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种梨黑斑病菌的检测方法及其引物，利用该引物及检测方法检测梨黑斑病菌，速度快，准确，灵敏度高，稳定可靠。

本发明提供的技术方案是:

一种用于检测梨黑斑病菌的引物，包括一对引物， 其特征在于：其上游引物序列如HB1所述，下游引物序列如HB2所述,其中，

HB1为：TCACCCTTGTCTTTTGCGTA

HB2为：ACCTTTGCTGATAGAGAGTG。

一种利用上述引物检测梨黑斑病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行检测，如果存在分子量约为400bp的DNA条带，则证明所检测样品中含有梨黑斑病菌。

上述的检测梨黑斑病菌的方法，所述PCR反应的扩增体系为：10×Taq buffer 2.5µL、25mmol/L MgCl₂ 2.0µL、2.5mmol/L dNTP 2.0µL、10µmol/L正反向引物各1. 0µL、5U/LTagase 0. 2µL、50 ng/µLDNA模板2µL,补水至总体积25µL。

所述的检测梨黑斑病菌的方法，所述PCR反应的反应程序为：94℃4min; 94℃30s, 55.8℃30 s, 72℃30 s, 35个循环; 72℃10min。4℃保存。

本发明还提供另一种检测梨黑斑病菌的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用两对引物进行套式PCR反应，第一轮PCR反应的模板为提取待测样品的DNA，引物为真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4，第二轮PCR反应的模板为第一轮PCR反应产物，引物为所述的引物HB1和HB2，取第二轮PCR反应扩增产物进行凝胶电泳检测，如果存在分子量约为400bp的DNA条带，则证明所检样品中含有梨黑斑病菌。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过设计一对特异性引物，结合PCR扩增的方法可以有效地检测植物组织中的梨黑斑病菌。本发明方法具有准确、快速、简单易操作等优点，可以在病害侵染初期鉴定出病原物，可参考应用于田间调查和植物产品的检验，对控制梨黑斑病的大面积爆发和跨区域传播具有重要意义，同时，本发明体系的建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和理论依据。