[发明专利]一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氧化应激测试方法，特别涉及一种成骨细胞氧化应激测试方法。

背景技术

骨质疏松症是老年常见的骨病，其特点是骨密度降低以及骨折风险明显增加，严重影响着老年人的生活质量。随着平均寿命的增加，骨质疏松症的患病率及其相关的并发症如骨折的发生率在不久的未来都将进一步的增加。老龄性骨质疏松症的诊断主要是通过骨骼的影像学检查、骨密度检测以及血液骨转换生化标志物的检测。尽管现在针对骨质疏松症的诊断和治疗策略很多，但仍无法降低骨折的发生率。因此，发展新的诊断和治疗策略是至关重要的。骨是一个基于持续的骨形成和骨吸收的稳定的动态结构。这两个过程必须是平衡的，一旦失调就会产生病理性的结构。以往，雌激素缺乏被认为不仅是女性，而且还是男性骨质疏松症发生的主要原因。更年期卵巢功能的降低导致了骨量的丢失，同时雌激素的替代可以阻止这种情况的发生，所以，成年人骨量的丢失始于性激素水平的下降。然而，大型流行病学研究已经清楚的证明，男性和女性的骨量丢失是发生在性激素改变之前，即在三十岁左右。因此，性激素缺乏并不能用来全面解释骨质疏松症的发生和发展。已有大量的证据表明随着机体的老化，体内增加的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)引起的氧化应激可以影响骨的体内平衡。发展新的治疗手段的，需要了解ROS如何参与调节骨的生物学、生理学和病理学。大量研究证据表明，ROS特别是H₂O₂和一些超氧化物，参与了细胞内不同的信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinas,MAPKs)，细胞内钙离子水平和转录因子的调控。ROS在促进氧化应激和疾病方面的有害影响近年来已引起高度关注。其中，氧化应激和骨质疏松症之间的关系是近年来研究的重点。

所以，成骨细胞进行氧化应激方法，将决定了最终氧化应激和骨质疏松症之间的研究结果，提供一种可行的成骨细胞进行氧化应激方法时非常有必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种成骨细胞氧化应激测试方法，特别是针对成骨细胞MC3T3E1细胞的氧化应激测试方法，该方法将成骨细胞MC3T3-E1细胞为对象，有效测试出氧化应激刺激能引起细胞的死亡，并损害成骨细胞的正常功能，抑制成骨细胞的分化，有助于阐明氧化应激在骨质疏松症发病机制中的作用，为抗骨质疏松症新药的研制提供一定的理论依据。

衰老是生物随着时间的推移，发生的一个不可逆的过程。它是复杂的自然现象，表现为结构和机能衰退，适应性和抵抗力减退，更易感染疾病。随着年龄的增加，自由基的产生增加。在衰老及其并发症中，体内增加的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)扮演着重要的角色。骨质疏松症是老年性疾病，患病率与年龄成正比。以往，雌激素缺乏被认为是骨质疏松症发生的主要机制。然而骨质的流失开始于三十岁，而且补充雌激素并不能有效治疗老龄性骨质疏松。衰老引起的骨质丢失是不依赖性激素的，氧化应激起了非常大的作用。

氧化应激可直接或间接地影响骨吸收与骨形成的过程。为了模仿衰老中ROS对骨代谢的影响，本发明对前成骨细胞MC3T3-E1进行H₂O₂刺激诱导氧化应激反应。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种MC3T3-E1成骨细胞氧化应激测试方法，其步骤包括，

(1)将α-MEM培养液37-40℃预热20-25分钟；然后将α-MEM培养液重悬MC3T3-E1细胞，均匀，接种于培养皿中，摇匀，放入37℃、5％CO₂培养箱中进行培养；

(2)每2-3天换一次液，3-5天后细胞达到80-90％汇合时弃去原培养液，胎牛血清洗净后，加入1ml浓度为0.25％Trypsin-EDTA放入37℃、5％CO2培养箱中1-2分钟，加入2ml培液终止消化，制成MC3T3-E1细胞悬液；

(3)取生长状态良好的MC3T3-E1细胞悬液接种于六孔板中，α-MEM培 养液预培养24小时使细胞贴壁；

(4)取步骤(3)中的浓度为0.1-1.0mmol/L的成骨细胞液，培养20-28小时后加入浓度为0.1-1.0mmol/L的过氧化氢溶液；

(5)去除原有α-MEM培养液，用正常α-MEM培养液清洗2-4次后再用PBS清洗1-3次，每孔加入10ul的CCK-8毒性/增殖检测试剂，37℃避光孵育3小时；

(6)在450nm波长处，测定各孔光吸收值即可。