[发明专利]一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用

权利要求书

1.CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体，由一个启动子来调控Cas9和向导RNA核心单元的转录，所述的启动子为PolⅡ型启动子，所述的核心单元从5’到3’方向依次为Cas9 ORF-Poly A-RZ cleavage site-gRNA cloning scaffold-RZ cleavage site-RZ，且gRNAcloning scaffold至少为一个，gRNA cloning scaffold之间为RZ cleavage site；其中，Cas9ORF即Cas9蛋白编码框，RZ cleavage site即核酶识别切割位点，gRNA cloningscaffold即gRNA克隆及转录单元，RZ即核酶全酶。

2.如权利要求1所述的骨架载体，其特征在于：gRNA克隆及转录单元为1～5个。

3.如权利要求1所述的骨架载体，其特征在于：Cas9蛋白编码框还包含核定位信号NLS序列，具有如Seq ID No.1所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1的骨架载体，其特征在于：gRNA克隆及转录单元，具有如Seq ID No.3中所示的核苷酸序列。

5.如权利要求1的骨架载体，其特征在于：所述的核酶全酶及对应识别的核酶识别切割位点通过以下方式配合使用：

对核酶全酶进行替换，同时对应替换核酶识别切割位点，且替换后的核酶识别切割位点被替换后的核酶全酶识别切割。

6.如权利要求5所述的骨架载体，其特征在于：所述的核酶全酶为锤头状核酶，其编码核苷酸序列如Seq ID No.6所示的序列。

7.如权利要求6所述的骨架载体，其特征在于：所述的核酶识别切割位点被锤头状核酶识别切割，其核苷酸序列如Seq ID No.5所示。

8.如权利要求1所述的骨架载体，其特征在于：所述Cas9ORF-poly A-RZ cleavagesite-gRNA cloning scaffold-RZ cleavage site-RZ具有如Seq ID No.7所示的核苷酸序列。

9.如权利要求1～8任一项所述的骨架载体，其特征在于：所述的PolⅡ型启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子CaMV35S、玉米Ubi1启动子ZmUbi1、拟南芥Ubi10启动子AtUbi10、巨细胞病毒CMV、热激蛋白70启动子hsP70或猴空泡病毒40启动子SV40。