[发明专利]一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用有效
申请号: | 201510397341.1 | 申请日: | 2015-07-08 |
公开(公告)号: | CN105132451B | 公开(公告)日: | 2019-07-23 |
发明(设计)人: | 张勇;郑雪莲;邓科君;唐旭;章登位 | 申请(专利权)人: | 电子科技大学 |
主分类号: | C12N15/79 | 分类号: | C12N15/79;C12N15/66 |
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地址: | 611731 四川省成*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 骨架载体 转录单元 转录 定向修饰 基因组 启动子 构建 协同 基因工程技术 特异性修饰 编辑体系 蛋白表达 核心单元 遗传修饰 有效实现 真核生物 重组载体 目标位 应用 物种 驱动 调控 | ||
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用。本发明要解决的技术问题是:现有CRISPR/Cas9基因组编辑体系物种通用性低及难以实现Cas9蛋白表达及gRNA转录的协同。本发明的技术方案是:构建CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体,由一个启动子来调控Cas9和向导RNA核心单元的转录。本发明还提供了采用所述的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体来构建针对目标位点特异性修饰Cas9‑gRNA重组载体的方法。本发明提供了一种高效的CRISPR/Cas9单一转录单元骨架载体,可以有效实现基于Pol II型启动子驱动的Cas9及gRNA单元的协同转录,针对多种真核生物进行简单、快捷、高效的基因组定向遗传修饰。
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种CRISPR/Cas9单一转录单元定向修饰骨架载体及其应用。
背景技术
近年来,随着模式动、植物基因组测序计划的推进及相关基因操纵技术的完善,针对基因组目标位点构建序列特异性核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN;transcriptionactivator-like effectors nuclease,TALEN;clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR-associated protein-9,CRISPR/Cas9),在目标生物基因组特异位点造成DSB,在生物体内源DNA修复系统作用下,可以实现目标基因组不同类型的定向遗传修饰。
CRISPR/Cas9基因组编辑体系中,CRISPR/Cas9对基因组目标序列的特异性切割主要依赖于向导RNA(guided RNA,gRNA)(tracrRNA及crRNA融合后的单一向导RNA单链)中crRNA与Cas9蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别目标序列上的PAM(protospacer adjacentmotif,前间区序列邻近基序)(5’-NGG-3’就是PAM的特征)及其相邻的20bp左右特异性靶序列(protospacer)。实验操作中需要构建含有Cas9蛋白及gRNA单元的表达载体,通过多样的转化方案,在目标生物细胞中进行Cas9蛋白表达及gRNA单元转录,进而Cas9蛋白与gRNA的核糖核蛋白复合物识别、结合、剪切目标生物基因组特定位点,之后在细胞内源DNA修复途径作用下实现不同类型的定向遗传修饰。
目前使用的CRISPR/Cas9基因组编辑体系中,Cas9与gRNA分别构建于独立的转录、表达单元中:Cas9蛋白表达单元依次由Pol II型启动子、Cas9 ORF、终止子构成,其中Cas9ORF需要融合NLS序列;gRNA转录单元依次由Pol III型启动子(多使用U6、U3等小RNA转录启动子)、gRNA单元(多采用Hwang等2013发表的tracrRNA+crRNA融合gRNA单元)、Poly T终止子构成。Cas9蛋白表达及gRNA转录单元可以分别构建在两个独立载体上进行共转化,也可以作为两个独立单元构建在单一载体上进行转化。其中:Cas9蛋白的表达可以依据转化目标的特性及实验要求选用适宜Pol II型启动子,如在动物细胞中常使用CMV、hsP70、SV40及植物中常用的CaMV35S、ZmUb1、AtUb10等启动子等;gRNA转录单元一般根据转化目标,使用目标基因组中特异的U6、U3等小RNA转录启动子。
但以上CRISPR/Cas9基因组编辑体系中,分别独立的Cas9蛋白表达单元及gRNA转录单元的设计存在固有缺陷,难以实现Cas9蛋白表达及gRNA转录的协同性。同时,由于gRNA单元的转录基本依赖物种偏好性强的U6、U3等Pol III型启动子,针对不同目标生物需要筛选特定的Pol III型小RNA转录启动子,而且也难以实现时空特异性及诱导转录调控,极大的限制了CRISPR/Cas9在基因组定向修饰中的工作效率及应用范围。
发明内容
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