[发明专利]一种RAPD标记竹节参及其近缘植物的品种鉴别的方法

说明书

本发明通过RAPD标记技术与人工绘制品种鉴定图（MCID）法相结合的方法，实现竹节参及其近缘人参属植物（人参、西洋参、三七以及竹节参变种狭叶竹节参、羽叶三七、珠子参）的快速鉴别。采用改良的CTAB法从叶片中提取竹节参及其近缘植物总DNA，从16条随机引物中筛选出能稳定扩增并且具有特异性条带的4条引物构建DNA指纹图谱，共扩增出46条条带，其中多态性条带42条，多态性比率为91.30%。根据特异性条带的有无，将竹节参及其近缘植物一一鉴别区分开，绘制图谱关系分析图，构成人工绘制品种鉴定图。该方法快速简单，结果直观可靠，为竹节参及近缘品种的初步鉴别提供了一种有效可行的方法。

技术领域

本发明涉及一种近缘植物品种鉴定的方法，具体为采用RAPD标记竹节参及其近缘植物的品种鉴别方法。

背景技术

竹节参为五加科人参属植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根茎，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血、祛痰的功效，用于病后虚弱，劳嗽咯血，咳嗽痰多，跌扑损伤，因此兼具我国北药人参的滋补强壮和南药三七的活血散瘀的作用，是我国西南地区土家族、苗族等聚居区常用中草药。与《中华人民共和国药典》规定不一致的是，民间也常把竹节参的三种变种狭叶竹节参Panax japonicus C.A.Mey.var.angustifius(Burk)Cheng etChu、羽叶三七Panax japonicus C.A.Mey.var.bipinnatidus(Seem.)C.Y.Wuet K.M.Feng、珠子参Panax japonicus C.A.Mey.var.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎混用作竹节参，然而研究表明，它们的化学成分以及药理活性不尽相同，因此，寻找有效方法鉴别这些药材，对于合理用药具有重要意义。

发明内容

为了将竹节参与其易混淆人参属近缘植物(人参、西洋参、三七以及竹节参变种狭叶竹节参、羽叶三七、珠子参)鉴别区分开，本实验通过RAPD分子标记技术，构建人工绘制品种鉴定图(MCID)，建立竹节参及其近缘植物的基因鉴别体系。

材料

竹节参、狭叶竹节参、羽叶三七以及珠子参的叶片新鲜品均采购于湖北恩施椿木营竹节参种植生产基地，三七叶片新鲜品采购于云南文山砚山县者腊乡，人参、西洋参的叶片新鲜品购自于吉林省白山市靖宇县。采集后用硅胶迅速干燥备用。试剂

PCR扩增试剂(Thermo Scientific公司，批号00140623)、CTAB(AMRESCO公司，批号3186B058)、PVP40(Sigma公司，批号BCBD7485)、琼脂糖(BIOWEST公司，批号111860)、GelRed染料(BIOTIUM公司，批号13G0307)、RNase A酶(Sigma公司，批号036M1298G)、DNA上样缓冲液(武汉科瑞生物技术有限公司，批号20150116)、1kb plus DNA Ladder[天根生化科技(北京)有限公司，批号M2206]。RAPD随机引物由上海生工公司合成。其余试剂均为分析纯。

仪器

BS110S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)、HH—4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、CT15RT高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)、梯度PCR仪(Applied Biosystems)、DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)、Gene Genius凝胶分析系统(英国SYNGNE公司)、LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器(上海华线医用核子仪器有限公司)。

方法

一种RAPD标记竹节参及其近缘植物的品种鉴别的方法，包括如下步骤：