[发明专利]虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法

权利要求书

1.虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)虾仁加工下脚料蛋白酶解物的制备：将虾仁加工下脚料用组织捣碎机粉碎，按照料液比1g：4～5mL加入磷酸盐缓冲液，于45～50℃下于超声功率400～500W下超声60～90min，然后加入中性蛋白酶，于45～50℃保温2～3h后，温度升至90～95℃并保持10～15min；溶液温度降至37～40℃，pH调至7.5～8.0，加入胰蛋白酶，保温2～3h后，温度升至90～95℃并保持10～15min后，于9000～10000g离心15～20min，得上清液，即虾仁加工下脚料蛋白酶解物；所述的虾仁加工下脚料含有虾头或虾壳；所述的磷酸盐缓冲液为0.2mol/L，pH6.5～7.5；

2)虾仁加工下脚料锌螯合肽的制备：将制备的蛋白酶解物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍NKA-9大孔树脂的层析柱中，用2～3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用3～5倍柱体积的30％和60％乙醇进行洗脱，收集60％乙醇洗脱液，于50℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化制备氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met、ESI/MS检测分子量为1027.20Da的虾仁加工下脚料锌螯合肽；

所述的反相高效液相色谱纯化制备具有如下步骤：

①固定化锌离子层析柱层析:将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10～20mg/mL的溶液，以0.5～1.5mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用3～5柱体积的水和0.1mol/L NaCl洗脱，收集0.1mol/L NaCl洗脱组分，即为亲和层析组分；

②凝胶柱层析：将亲和层析组分溶于双蒸水配成浓度为10～20mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据214nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物；

③RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成45～55μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化；

所述RP-HPLC条件为：进样量8～10μL；色谱柱为Zorbax C18；流动相：15％乙腈；洗脱速度0.5～0.8mL/min；紫外检测波长220nm；

根据对Zn的螯合活性得1个高Zn螯合活性胶原肽；

④结构检测：Zn螯合胶原肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Trp-Gly-Phe-Thr-Cys-Trp-Pro-Met，ESI/MS检测分子量为1027.20Da。