[发明专利]虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法

说明书

本发明涉及一种虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法，具体讲是以虾仁加工下脚料为原料，采用酸法提取胶原蛋白，利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对胶原蛋白进行酶解，采用超滤、大孔树脂柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到锌螯合胶原肽。锌螯合胶原肽由于其独特的螯合和转运机制，吸收利用度高，又可同时补充多肽/氨基酸和锌，是一种理想的补锌物质。

技术领域

本发明属于水产品精深加工技术领域，涉及一种离子螯合肽的制备方法，尤其涉及虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法。

背景技术

我国的虾类资源非常丰富，近年来随着虾仁加工业的迅速发展，产生了大量的加工下脚料，这些下脚料中富含蛋白质、甲壳素以及虾青素等有效物质。经调查发现，我国以虾为主要原料的生产企业在处理虾类加工下脚料时，一部分以极低价格作为废料外售，或者运送到养殖场烘干粉碎作为饲料，还有很多未来得及处理的下脚料由于堆砌一处发霉腐烂，最终直接运往垃圾场。不但造成严重的资源浪费，而且还会引起环境污染。国外对虾加工下脚料的综合利用非常重视，并进行了深入的研究，在理论和实践方面均取得了系列成果，为我国虾仁加工下脚料的回收利用提供了依据。近年来，我国随着对环境保护的加强，虾仁加工下脚料的回收利用成为水产加工企业迫切需要解决的问题。目前我国主要还是用于生产甲壳素，对于蛋白和虾青素的回收利用由于成本高尚实现工业化生产。

经检索，以虾仁加工下脚料制备锌螯合肽未见报道。基于此，本发明根据锌螯合肽和虾仁加工下脚料的研究现状，提供一种具有金属锌螯合活性的多肽，并提供这种锌螯合肽的制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种锌离子螯合效果好的虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种虾仁下脚料锌螯合肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）虾仁加工下脚料蛋白酶解物的制备：将冷冻虾仁加工下脚料（虾头和虾壳）用组织捣碎机粉碎，按照料液比1 g：4～5 mL加入磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH 6.5～7.5），于45～50℃下于超声功率400～500W下超声60～90 min，然后加入中性蛋白酶（酶活力≥5.0×10⁴ U/g），于45～50℃保温2～3 h后，温度升至90～95℃并保持10～15 min；溶液温度降至37～40℃，pH调至 7.5～8.0，加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×10⁴ U/g）保温2～3 h后，温度升至90～95℃并保持10～15 min后，于9 000 ～10 000g离心15～20 min，得上清液，即虾仁加工下脚料蛋白酶解物。

2）虾仁加工下脚料锌螯合肽的制备：将制备的酶解物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有8～10倍NKA-9大孔树脂的层析柱中，用2～3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用3～5倍柱体积的30%和60%乙醇进行洗脱，收集60%乙醇洗脱液，于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得多肽混合物，多肽混合物依次经固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到虾仁加工下脚料锌螯合肽。

作为优选，固定化锌离子层析柱层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：

固定化锌离子层析柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10～20 mg/mL的溶液，以0.5～1.5 mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用3～5柱体积的水和0.1 mol/L NaCl洗脱，收集0.1 mol/L NaCl洗脱组分，即为亲和层析组分。

凝胶柱层析：将上述多肽混合物溶于双蒸水配成浓度为10～20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-15柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰为凝胶层析酶解物。