[发明专利]直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用

说明书

本发明公开了直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用。本发明提供了一种使肝细胞重编程为胰岛β细胞的方法，包括如下步骤：将Pdx1蛋白编码基因、Pax4蛋白编码基因和Neurod1蛋白编码基因转染离体肝脏细胞，得到胰岛β细胞；本发明的优势在于，第一，采用非病毒EntransterTM‑D转染试剂，不但具有较高的转染效率，同时大大提高了直接重编程过程中转染的安全性。第二，根据文献的报道，筛选出适用于直接重编程为胰岛β细胞新的最佳转染组合Pdx1、Pax4、Neurod1。第三，根据各个转录因子发挥作用的先后顺序，筛选出最佳转染时段24h，从而提高了直接重编程为胰岛细胞的成熟度问题，本研究中重编程效率达23％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用。

背景技术

目前，糖尿病仍是困扰世界各国的严重社会卫生难题，糖尿病患病率呈急剧上升趋势。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,是由于T细胞参与的胰岛β细胞选择性破坏所致，胰岛细胞移植技术存在供体缺乏及免疫抑制，应用受到限制。因此，越来越多研究关注寻求胰岛素分泌细胞的来源问题。

细胞直接重编程技术，是2006年Takahashi和Yamanaka等发现的诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)之后的一项新技术。该技术不同于诱导性多能干细胞，它是指将一种终末分化的细胞直接转变为另外一种成体细胞。细胞直接重编程技术，突破了伦理、免疫排斥、来源不足等问题，具有相对安全、重编程时间较短及靶向性好的优点。这一技术的开展，为自体细胞替代治疗提供了的新方向。但直接重编程技术目前主要处于研究阶段，应用到临床疾病治疗仍有一定的距离，其中在重编程效率和成熟度及安全性方面还有待于进一步的完善和提高，但相信通过不断的努力，这一技术将会为临床疾病的治疗带来新的途径。

关于糖尿病的治疗，最早源于埃德蒙顿(Edmonton)方案的提出，胰岛移植技术的开展为糖尿病的替代治疗开创了先河，然而，这一技术的免疫排斥及胰岛供体的不足，使得这一技术应用上受到限制，这就需要寻求新的胰岛素分泌细胞来源。近年来研究发现，干细胞的诱导分化，成为胰岛素分泌细胞来源的一个新的突破点。从胚胎干细胞的诱导分化、间充质干细胞的诱导分化到目前研究热点诱导性多能干细胞(induced pluripotent stemcells,iPSCs)的形成，重编程技术的发展，为这一领域的研究带来新的希望。然而，这些转变的过程中存在着伦理、免疫排斥及肿瘤风险等，需要研究新的靶目标来实现用胰岛素分泌细胞进行糖尿病的替代治疗。细胞直接重编程技术的核心就是关键转录因子的筛选。Ferber等通过Pdx1基因腺病毒载体介导的经尾静脉注入糖尿病模型小鼠，研究发现，Pdx1蛋白在小鼠的肝、肾、心、上皮组织均有表达，表达水平最高的为肝细胞，转染后1周小鼠血糖变化由33.3mmol/L降到11.1mmol/L，其中，肝脏中胰岛素分泌量是对照组的25倍。Yang等利用单纯疱疹病毒VP16蛋白激活域与Pdx1融合，由慢病毒载体介导，体外转染肝细胞后，肝卵园细胞株(WB cell line)选择性转化为有胰岛素分泌能力的β细胞，随后又采用慢病毒载体将Pdx1和Pdx1—PV16分别转染体外培养的肝卵园细胞株，结果显示在高葡萄糖培养基的环境中，Pdx1-PV16的作用下胰岛素分泌能力更为明显。研究发现，Pdx1作用后期胰岛素表达能力丧失的细胞，通过转染Neurod1这些细胞又重新恢复了胰岛素表达能力，表明Neurod1和Pdx1具有协同表达胰岛素分泌细胞的特性。可见，Pdx1可以有效驱动胰芽的形成，但是仅有Pdx1并不能定向驱动细胞进一步发育而成，需要Ngn3、Neurod1、Mafa、Pax4等的相互作用。2008年，zhou等筛选出的最佳转录因子组合Pdx1、Ngn3、Mafa(PNM)成功将小鼠胰腺外分泌细胞直接重编程为胰岛素分泌细胞，达到20％的重编程效率，不足之处在于缺乏完整的胰岛样结构，胰岛素的分泌量远不及正常的胰岛β细胞。为了深入研究这一过程的基因层面的变化，2012年，Akinci通过转染该组合到大鼠AR42j-B13细胞系后发现，有大量胰岛 β细胞特性基因表达，并从组蛋白和甲基化层面对Pdx1进行分析，染色体被PNM组合所修饰，促进这些特异性基因的表达。同年，他们又将PNM组合构建成串联载体，尾静脉输注的方式将小鼠体内重编程，发现了串联载体在肝脏内具有明显的聚集性，实现了对肝脏细胞的直接重编程，并且发现了导管样结构，证实是来源于SOX9+细胞。鉴于胆囊和胰腺的同源性，Hickey等发现，通过转染转录因子Pdx1、Mafa、Neurog3实现了小鼠胆囊细胞向胰岛素分泌细胞的转变。研究发现，人类胰岛组蛋白的甲基化是由于H3K4me3和H3K27me3的作用所致，使得α、β细胞的转变。为了更加深入的研究与人类相关的直接重编程技术，Pennarossa等选取猪为重编程的对象，此次重编程与之前的不同点在于使用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-胞嘧啶(5-aza-CR)诱导所形成，重编程效率达(38.1±9.2)％。Berneman-Zeitouni等通过转录因子Pdx1、Pax4和Mafa的顺序进行不同方式的转染，发现三个转录因子间隔24h转染，重编程肝细胞为胰岛素分泌细胞，转分化效率达到15％，不但效率较高，同时具有较高的成熟度，为细胞重编程技术的发展带来了新的突破。直接重编程技术既避免了胰岛移植供体不足和免疫排斥等限制，也可避免干细胞分化的胰岛素细胞转分化效率低以及安全性问题。