[发明专利]一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)侵染小麦组织的染色方法

说明书

本发明提供了一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)侵染小麦组织的染色方法，属于真菌染色技术领域。所述染色方法包括如下步骤：(1)固定：取不同生长时期的小麦组织样品，在无水乙醇固定液浸泡不少于24h；(2)染色：将样品先置于含10μg/ml Propidium Idodide和0.02％Tween20的A染色液中浸泡15min,然后置于20μg/ml WGA‑AF488的B染色液中20min，最后用1×PBS pH 7.4冲洗；(3)将处理后样品置于载玻片上加盖玻片倒置后在激光共聚焦显微镜下观察是否有菌丝侵染。同时，本发明还提供了基于所述染色方法的用于确定小麦黑穗菌侵染小麦组织的试剂盒。采用所述染色方法和试剂盒对小麦组织进行染色，实现在任意生长阶段的各种小麦组织中获得较好的黑穂菌染色效果并确认该组织对应的小麦植株是否被黑穂菌侵染，具有操作简单、便捷、有效、限制少、效果好等特点。

技术领域

本发明涉及真菌染色技术，特别是一种采用Wheat Germ Agglutinin,Alexa488Conjugate(WGA-AF 488)染剂标记小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)从而确定小麦组织是否被侵染的方法。

背景技术

小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)属真菌界黑粉菌科腥黑粉菌属，是引起的小麦矮腥黑穗病是一种重要的国际检疫性病害，对小麦生产造成严重的危害，也是我国外来生物入侵研究的主要物种之一。

基于形态学观察和鉴定目的的常见的真菌染色方法包括：高碘酸无色品红法(PAS法)、HE染色、六胺银法(GMS法)、黏液胭脂红法(Mucincarmine法)、阿尔辛蓝法(AB法)、无色品红醛品红法(Gridley法)等，但这些方法都不能获得较好的TCK染色效果。

现有技术中存在一种根据黑穂病菌的自发荧光显微学特性甄别小麦矮腥黑穗病菌和小麦网腥黑穗病菌(T.carves Tul.,TCT)的方法，即，在Strockwell等人的方法上做了相应的改进，能够在观察数量足够多的情况下很好地鉴别TCK和TCT。

同样属于黑粉菌科的茭白黑粉菌，现有技术中有一种快速观察其菌丝的方法，即Latude-Dada(1996)方法的改进，包括：首先在脱色液(0.15％三氯乙酸溶解在3∶1(w/v)的乙醇和氯仿混合液中)中脱色，蒸馏水漂洗3次后，用0.025％苯胺蓝乳酚油染色液进行染色，然后置于激光共聚焦显微镜下观察即可。

然而，目前该领域尚未存在一种能够实现在任意生长阶段的各种小麦组织中获得较好的黑穂菌染色效果并确认该小麦组织是否被侵染的方法。

发明内容

基于本领域如上所述的空白和需求，本发明提供了一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)侵染小麦组织的染色方法。技术方案如下：

一种用于确定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)侵染小麦组织的染色方法，包括如下步骤：

(1)固定：取不同生长时期的小麦组织样品，在无水乙醇固定液浸泡不少于24h；

(2)染色：将样品先置于含10μg/ml Propidium Idodide和0.02％Tween20的A染色液中浸泡15min,然后置于20μg/ml WGA-AF 488的B染色液中20min，最后用1×PBS pH 7.4冲洗；

(3)将处理后样品置于载玻片上加盖玻片倒置后在激光共聚焦显微镜下观察是否有菌丝侵染。

所述小麦组织样品指叶片、茎秆、花药或子房。

所述小麦组织样品指叶片，需剪段成5mm左右的方块且去掉四周边缘。

所述小麦组织样品指孕穗期样品，需分离子房和花药。