[发明专利]一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种启动子，尤其涉及一种一种利用分子生物学手段获得的在植物非分泌型腺毛中特异表达的萜类合成酶基因启动子(proFDS1)及其在转基因植物中的应用。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、挥发油、α-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含有黄酮类化合物。青蒿素(Artemisinin)是从其地上部分分离出的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，作为世界卫生组织(WHO)推荐的抗疟疾药物联合治疗(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)的主要有效成分。目前青蒿素的主要来源是从青蒿的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，这使得这种药物的大规模商业化生产受到了极大限制。

青蒿的叶片表面有两种腺毛：分泌型腺毛(glandular secretory trichome，GST)和非分泌型腺毛(T shape trichome,TST)，两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用。启动子是位于结构基因5'端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在目前青蒿的基因工程研究中，多采用组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)，这种启动子能够驱动外源基因在所有的组织和器官中表达，会过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能在时间和空间上调控目的基因的表达，极可能会对植物的正常生长造成一定的负担和危害。因此急需找到在植物的组织器官中特异性表达的启动子来代替组成型启动子，从而更好的对植物基因的表达进行调控。由于腺毛特异表达的启动子对于植物的腺毛系统进行遗传操作，不会对植物的生长发育造成危害，可以克服组成型启动子的种种弊端。因此，本发明致力提供一种克隆到植物腺毛组织特异表达的启动子。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，同时为深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控。本发明提供一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的启动子，能引导基因在转基因植物非分泌型腺毛中特异表达。所述启动子为萜类合成酶基因启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述启动子为诱导型启动子。

本发明还提供一种如上所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子，可应用在在植物生产代谢产物的基因工程育种中。

进一步地，所述启动子为特异型启动子，能够代替组成型启动子引导外源基因在植物非分泌型腺毛中特异表达。

本发明还提供一种载体连接有如上述所述的调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子。

本发明还提供一种调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、培养青蒿无菌苗；

步骤二、克隆调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子基因组序列；

步骤三、分析调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件，确定所述启动子类型；

步骤四、将克隆到的所述启动子通过酶切连接连入pCAMBIA1391z载体中；

步骤五、将步骤四中构建好的所述载体转化根癌农杆菌；

步骤六、将步骤五中带有载体的根癌农杆菌稳定转化青蒿；

步骤七、PCR检测转基因植株；

步骤八、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中表达部位。

进一步地，所述步骤二为以基因组DNA为模板，采用两轮巢式PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子序列。

进一步地，所述步骤三中调控基因在非分泌型腺毛中表达的启动子上面的顺式作用元件包括：TATA box、CAAT box、G-box、AE-box、ARE、GA-motif、GARE-motif和GATA-motif。

启动子序列中调控元件见下表1：

表1 启动子序列中调控元件分析

进一步地，所述步骤四中，为构建pCAMBIA1391z载体，正向引物中引入PstI酶切位点，反向引物中引入EcoRI酶切位点，引物序列如下所示：