[发明专利]类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶及制备方法。

背景技术

与植物来源和动物来源的凝乳酶相比较，微生物来源的凝乳酶具有生产成本低、生化多样性高、基因易改造的优势。目前，越来越多的报道说明微生物的胞外蛋白酶具有凝乳功能，部分微生物的凝乳酶已实现大规模工业化生产，并广泛应用于干酪生产中。能够产生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要属于放线菌、细菌和霉菌等的范畴，包括放线菌中的链霉菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属，霉菌中根霉、总状毛霉、微小毛霉、米黑毛霉、易脆毛霉，细菌中粟疫菌、寄生内座壳菌以及其他通过基因工程或辐照获得的高产凝乳酶的菌株等。

将凝乳酶从发酵上清中分离出来并实现凝乳酶的高效回收是分离纯化、酶学性质研究以及工业化生产凝乳酶的前提和基础。常用的分离方法有盐析法、有机溶剂沉淀法(乙醇、丙酮)以及等电点法，其中，盐析、乙醇和丙酮沉淀应用最为广泛。例如，有学者使用1％氯化钠溶液浸提微小毛霉发酵液中的凝乳酶，后用95％的乙醇对浸提物进行沉淀；有学者使用乙醇按不同比例分步提取微小毛霉发酵液中的凝乳酶；还有学者以总状毛霉R132的发酵液为研究对象，对其超滤后进行乙醇分步提取。另有其他学者利用丙酮、乙醇等对栗疫菌、根霉、青霉、曲霉、枯草芽孢杆菌、粘球菌、粪肠球菌产凝乳酶进行初步分离提取。

中国专利申请(CN103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种类芽孢杆菌BD3526，Paenibacillus damxungensis sp.nov.，并将其于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。中国专利申请(CN104450655A)公开了使用乙醇提取类芽孢杆菌BD3526麸皮发酵液上清中凝乳酶，但是其操作工艺复杂，所得凝乳酶的回收率低，难以满足大规模工业化生产的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶时，所得的发酵物粘稠难以将凝乳酶纯化分离，所得的凝乳酶回收率低，难以满足大规模工业化生产的需要的不足，提供一种利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶的方法。所述的方法达到了凝乳酶回收率高和粗酶样品中多糖含量较低的良好效果。

本发明发明人发现，类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有高产凝乳酶的特性外，还具有很强的胞外多糖的合成能力，发酵液中的多糖具有强的悬浮性能，不能实现凝乳酶和胞外多糖的有效分离。利用乙醇沉淀时，凝乳酶回收率虽高，但混杂了很多的胞外多糖，溶解性能差、黏度很高，限制了后期分离纯化和酶学性质研究，在工业化生产上也不具备可行性，因此本发明人对类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵液分离纯化凝乳酶的工艺进行调整改进。

本发明提供一种利用类芽孢杆菌(Paenibacillus damxungensis sp.nov.)CGMCC No.8333发酵液制备凝乳酶的方法，其包括以下的步骤：

(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的发酵液离心得发酵上清液；

(2)将步骤(1)所得发酵上清液与硫酸铵混合得混合液，所述混合液中硫酸铵的饱和度为50～75％，2～6℃静置混合液0～5h，离心收集沉淀物；

(3)将步骤(2)所得沉淀物溶解，离心，取上清液，即得凝乳酶。

步骤(1)为：将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的发酵液离心得发酵上清液。其中，较佳地，发酵液是由包括以下的步骤制备而得的：将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液接种于麸皮培养基发酵培养得发酵液。所述的麸皮培养基为本领域常规的麸皮培养基，其包括麸皮和水。所述的麸皮为本领域常规的麸皮，较佳地为小麦麸皮。所述麸皮的含量为本领域常规的含量，较佳地为1％～5％，更佳地为2％，所述百分比为质量百分比。较佳地，所述发酵培养在锥形瓶中进行，更佳地在250mL锥形瓶中进行。所述锥形瓶中所述的麸皮培养基的装液量为本领域常规装液量，更佳地为50mL。所述发酵培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为48～72小时。所述发酵培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28～30℃。所述的种子液的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为2～4％，所述百分比为体积百分比。所述发酵培养的方式为本领域常规的方式，较佳地为震荡培养。所述震荡培养的速度为本领域常规的速度，较佳地为180～300r/min。