[发明专利]一种犬细小病毒增殖方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒培养技术领域，进一步涉及疫苗抗原制备技术领域，具体涉及一种犬细小病毒增殖方法。

背景技术

犬细小病毒(Canineparvovirus，CPV)属细小病毒科细小病毒属，主要感染犬，尤其幼犬，健康犬感染CPV后，病毒主要攻击肠上皮细胞和心肌细胞，分别表现胃肠道症状和心肌炎症状，犬细小病毒具有极强的传染性，犬感染后死亡率较高。对于犬细小病毒感染病例，临床上主要是对症治疗配合高免血清和单克隆抗体治疗，从疗效、成本等方面考虑都不尽理想，综合来看通过疫苗免疫是应对该病毒的根本措施。这就涉及到犬细小病毒抗原的增殖技术。

现有技术中犬细小病毒抗原生产主要采用细胞转瓶培养方法，转瓶工艺生产抗原病毒含量较低，仅为10^4.5～6.0TCID₅₀/ml，不能提供稳定合格抗原(合格抗原每毫升抗原含量应≥10^7.0TCID₅₀/ml)，需要进行高倍浓缩，且转瓶工艺劳动强度大，生产一批需要100～200个转瓶，需多人同时进行长时间的消化传代操作，增加污染风险；生产周期长，需要20天；效率较低，每次培养只能收获一次；生产成本较高，人工、场地及原料费用大；对环境要求较高，需要较大的场地和GMP厂房；不同生产批次及同一生产批次的转瓶之间存在较大差异，容易造成批内及批间的抗原质量差异，进而影响病毒抗原质量的稳定性；转瓶清洗需要大量水，并且产生的含毒废水需要专门处理，容易对环境造成污染，如处理不当会造成生物安全和公共卫生问题。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种犬细小病毒增殖方法，以解决现有技术中存在的培养效率较低的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是现有技术的犬细小病毒增殖方法质量不稳定。

本发明解决的再一技术问题是现有技术的犬细小病毒增殖方法产量较低。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种犬细小病毒增殖方法，该方法以F81细胞作为宿主细胞增殖犬细小病毒，同时以激流式生物反应器作为细胞培养装置。

优选的，该方法是先以激流式生物反应器培养F81细胞，而后再向细胞培养液中接种犬细小病毒，增殖细小病毒。

优选的，所述培养F81细胞，是在激流式生物反应器中采用微载体悬浮培养的方式培养F81细胞。

优选的，该方法包括以下步骤：

1)向激流式生物反应器中加入细胞培养液，以(0.1～1)×10⁶个细胞/mL培养液的比例接种F81细胞培养，所述反应器中具有微载体；

2)当细胞密度达到(1～10)×10⁶个细胞/mL培养液时以0.01～0.03MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，继续培养细胞；

3)取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。

优选的，步骤1)中细胞培养液的加入量为激流式生物反应器最大装液量的1/2～3/4。

优选的，步骤1)中用于接种的F81细胞，是经EDTA-胰酶细胞分散液消化得到F81细胞悬液。

优选的，步骤2)中当细胞密度达到(1～10)×10⁶个细胞/mL培养液时，继续培养细胞4～6h，而后以0.01～0.03MOI的接种量向培养液中接入犬细小病毒，再继续培养细胞。

优选的，步骤3)中当微载体上细胞全部脱落后，取培养液固液分离，收集上清即得到犬细小病毒液。

优选的，所述细胞培养液包括以下成分：85～90％(w/w)的DMEM液，青霉素钠80～120单位/ml，链霉素80～120单位/ml，余量为牛血清；所述培养基pH为7～7.8。

优选的，步骤1)中对细胞的培养或步骤2)中接种犬细小病毒后对细胞的培养，满足以下培养条件：培养温度35～39℃，培养液pH7～7.8，培养液溶氧45～55％，搅拌速度50～70rpm。