[发明专利]一种可同时鉴别TGEV和PEDV病毒的双重RT-PCR方法在审
| 申请号： | 201510411851.X | 申请日： | 2015-07-14 |
| 公开（公告）号： | CN105154583A | 公开（公告）日： | 2015-12-16 |
| 发明（设计）人： | 宋磊;吕茂杰;杨保收;付旭彬;梁武 | 申请（专利权）人： | 天津瑞普生物技术股份有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93 |
| 代理公司： | 北京金智普华知识产权代理有限公司 11401 | 代理人： | 李明卓 |
| 地址： | 300308 天津市滨海新区空港*** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 同时 鉴别 tgev pedv 病毒 双重 rt pcr 方法 | ||
1.一种用于鉴别TGEV和PEDV的方法，该方法包括以下步骤：
1）提取待测样品中病毒RNA；
2）将步骤1）得到的RNA反转录为cDNA；
3）将步骤2）得到的cDNA针对其中目的基因执行PCR扩增；
4）对扩增产物测序，以确定其中是否含有目的基因；
其特征在于：所述目的基因分为TGEV目的基因和PEDV目的基因，其中所述TGEV目的基因是TGEV的S蛋白基因，所述PEDV目的基因是PEDV的S蛋白基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）中用于PCR扩增的引物是序列如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的两种DNA分子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）中用于PCR扩增的引物是序列如SEQIDNO3和SEQIDNO4所示的两种DNA分子。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于PCR反应体系包括以下成分：10×PCRbuffer4～6μL，dNTPMixture3～5μL，ExTaq0.4～0.6μL，SEQIDNO1所示的引物浓度为8～12μM，SEQIDNO2所示的引物浓度为8～12uM，CDNA模板2～3μL，ddH2O30～35μL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于PCR反应条件为：93～95℃预变性，4～6min，93～95℃变性48～52s，53～55℃退火48～52s，70～74℃延伸48～52s，共33～37个循环，70～74℃终延伸8～12min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于PCR反应体系包括以下成分：10×PCRbuffer4～6μL，dNTPMixture3～5μL，ExTaq0.4～0.6μL，SEQIDNO3所示的引物浓度为8～12μM，SEQIDNO4所示的引物浓度为8～12uM，CDNA模板2～3μL，ddH2O30～35μL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于PCR反应条件为：93～95℃预变性，4～6min，93～95℃变性48～52s，53～55℃退火48～52s，70～74℃延伸48～52s，共33～37个循环，70～74℃终延伸8～12min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）中用于PCR扩增的引物是四种DNA分子，其序列分别如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于PCR反应体系包括以下成分：10×PCRbuffer4～6μL，dNTPMixture3～5μL，ExTaq0.4～0.6μL，SEQIDNO1所示的引物浓度为8～12μM，SEQIDNO2所示的引物浓度为8～12uM，SEQIDNO3所示的引物浓度为8～12μM，SEQIDNO4所示的引物浓度为8～12uM，CDNA模板2～3μL，ddH2O30～35μL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于PCR反应条件为：93～95℃预变性，4～6min，93～95℃变性48～52s，53～55℃退火48～52s，70～74℃延伸48～52s，共33～37个循环，70～74℃终延伸8～12min。
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