[发明专利]一种可同时鉴别TGEV和PEDV病毒的双重RT-PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种可同时鉴别TGEV和PEDV病毒的双重RT-PCR方法。

背景技术

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)能够引起猪病毒性腹泻，多发生于冬、春两季，传播迅速。这种急性肠道传染病在临床上的主要特征为体温急剧升高，极度口渴，饮水量增加，不愿采食或采食停止，呕吐，随后剧烈腹泻并迅速脱水。TGEV和PEDV可以感染各年龄猪，其中对仔猪的危害最大，严重影响饲料转化率，导致大量仔猪死亡，造成重大的经济损失。近年来，亚洲各猪场爆发了严重的猪流行性腹泻疫情，给养猪业造成了巨大的经济损失。TGEV与PEDV同属冠状病毒，在临床症状、病理变化、流行病学上极为相似，因此在临床上很难将其区分，所以用分子生物学方法来区分二者势在必行。

双重RT-PCR方法是在同一反应体系中加入两对引物对两个目的基因同时进行PCR扩增的实验方法。因其具有省时、省力、降低检测成本、减少样品污染等优点现已发展成一种通用检测技术，并成功用于分子遗传学、疾病诊断、病原鉴别等各个方面。双重RT-PCR能够捕获更多信息且快速精确检测出微量核酸，因此有望用于鉴别TGEV和PEDV病毒，然而在确定使用RT-PCR方法实施鉴别的大方向基础上，选择病毒的哪种基因作为目的基因，设计怎样的引物，选择怎样的反应体系和反应条件都是能否利用该方法成功鉴别、检测两种病毒的必要条件。现有技术中，对于上述问题尚缺乏一种有效的解决手段。

TGEV的基因组为不分节段的单股正链RNA，长度约为28.5kb，基因组编码8个ORF；TGEV有4种结构蛋白(S、M、N、sM)和3种非结构蛋白，其中S蛋白又称为纤突蛋白，编码该蛋白的基因称为S基因。PEDV基因组也是单股正链的RNA，全长27～33kb，基因组序列包括6个ORF，从5′-3′依次为编码复制酶多聚蛋白1ab(pplab)、纤突蛋白(S)、ORF3蛋白、次要嵌膜蛋白(E)、主要嵌膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)的基因；其中S蛋白是由1383个氨基酸组成、分子质量为180～220ku、位于病毒粒子表面的纤突蛋白，它在识别靶细胞，促进病毒和细胞膜的融合中发挥重要地生物学作用。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种可同时鉴别TGEV和PEDV病毒的双重RT-PCR方法，以解决现有技术中缺乏一种能够同时鉴别TGEV、PEDV病毒的方法的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是提升上述方法鉴别、检测的敏感性。

本发明解决的再一技术问题是提升上述方法鉴别、检测的特异性。

本发明解决的又一技术问题是降低TGEV、PEDV病毒鉴别实验的成本。

一种用于鉴别TGEV和PEDV的方法，该方法包括以下步骤：

1)提取待测样品中病毒RNA；

2)将步骤1)得到的RNA反转录为cDNA；

3)将步骤2)得到的cDNA针对其中目的基因执行PCR扩增；

4)对扩增产物测序，以确定其中是否含有目的基因；

其中：所述目的基因分为TGEV目的基因和PEDV目的基因，其中所述TGEV目的基因是TGEV的S蛋白基因，所述PEDV目的基因是PEDV的S蛋白基因。

优选的，步骤3)中用于PCR扩增的引物是序列如SEQIDNO1和SEQIDNO2所示的两种DNA分子。在此基础上可以进一步执行以下优选：PCR反应体系包括以下成分：10×PCRbuffer4～6μL，dNTPMixture3～5μL，ExTaq0.4～0.6μL，SEQIDNO1所示的引物浓度为8～12μM，SEQIDNO2所示的引物浓度为8～12uM，CDNA模板2～3μL，ddH₂O30～35μL；PCR反应条件为：93～95℃预变性，4～6min，93～95℃变性48～52s，53～55℃退火48～52s，70～74℃延伸48～52s，共33～37个循环，70～74℃终延伸8～12min。