[发明专利]一种汞‑IgE螯合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种汞-IgE螯合物，其特征在于，汞离子与IgE通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成；

所述汞-IgE螯合物的制备方法，包括以下步骤：

A）汞与IgE的螯合反应：在提纯源于人体的IgE或按照生物学方法重组的IgE中加入汞离子进行螯合反应，得到反应溶液；

所述步骤A）具体如下：

1）透析袋的处理：将透析袋放入500mL的EDTA-NaHCO₃混合溶液中，煮沸10min；倾弃EDTA/NaHCO₃液，用超纯水轻轻漂洗，再用500mL的 5mmol/L EDTA溶液煮沸10min；弃掉煮沸液，用超纯水彻底清洗，加入超纯水浸泡透析袋4℃过夜；使用时，戴上手套，取出透析袋，用超纯水彻底冲洗其内外表面；

2）取2.0mg ITCBE溶于2mL DMSO中；

3）取4.0mg IgE溶于4.0mL硼酸盐缓冲溶液中；

4）缓慢将步骤2）配制的液体加入步骤3）配制的IgE溶液中，边滴加边震荡，置于温度为25℃，转速为100r/min的摇床中反应24h，然后用透析袋透析24h，除去未与IgE结合的ITCBE；

5）将步骤4）所得的液体用1mol/L HCl调节pH值至7.0，然后缓慢逐渐滴加80μl的 1mmol/L 汞离子溶液，边滴加边振荡，以免汞离子使蛋白变性沉淀；

6）将步骤5）所得的溶液置于温度为25℃，转速为100r/min的摇床中反应2h，用透析袋进行透析24h；

7）将步骤6）透析后的液体于-20℃分装保存，得到反应溶液；

B）纯化汞-IgE螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的IgE以及多余的汞离子，即得汞-IgE螯合物；

所述步骤B）具体如下：

（1）溶解样品：向经过步骤A）得到的反应溶液中加入生理盐水使汞-IgE螯合物复溶；

（2）平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgE特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；

（3）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1）中样品，然后上柱，IgE与填料特异性结合；

（4）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；

（5）收集：收集洗脱液Ⅰ；

（6）透析：将步骤（5）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH₂O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；

（7）平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与汞特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；

（8）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6）中样本，然后上柱；

（9）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；

（10）收集：收集洗脱液Ⅱ；

（11）透析：将步骤（10）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH₂O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得汞-IgE螯合物。

2.一种如权利要求1所述的汞-IgE螯合物的制备方法，其特征在于，还包括步骤C）：对汞-IgE螯合物的鉴定；

其中，步骤C）中具体如下：

（1）制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；

（2）加样：取步骤B）中提取纯化得到的汞-IgE螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；

（3）电泳：连接电泳板，进行电泳；

（4）检测：在胶床上找出含汞的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有汞以及检测汞的含量。

3.一种如权利要求1所述的汞-IgE螯合物在制备检测血样中汞-IgE螯合物的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种至少包括如权利要求1所述的汞-IgE螯合物作为标准品的试剂盒。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括包被液，该包被液含有捕获IgE的物质或捕获汞的物质。

6.一种定量检测汞-IgE螯合物的方法，其特征在于，以已知含量的权利要求1所述的汞-IgE螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法、提纯汞-IgE螯合物与酶联免疫结合法、提纯汞-IgE螯合物与原子吸收光谱结合法、提纯汞-IgE螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。