[发明专利]一种检测发热伴血小板减少综合征病毒的恒温扩增试剂盒及应用

权利要求书

1.检测发热伴血小板减少综合征病毒的寡核苷酸，包括上下游链置换引物、上下游探针和交叉扩增引物；

所述上下游链置换引物分别为

SFTS-M-F3：5′-TGGATGTTGGCCACTCTC-3′；

SFTS-M-B3：5′-TTCTTCTGATTCAGAACA-3′；

所述上下游探针分别为

上游5′端FITC标记探针

SFTS-M-DF5F：5′-FITC-GAGAGCTCATCCAAGGAT-3′；

下游5′端Biotin标记探针

SFTS-M-DF5B：5′-Biotin-AGCACAAGACCAAATGGGT-3′；

所述交叉扩增引物为

SFTS-M-CPR：

5′-AGCACAAGACCAAATGGGTTCCCTTCCTTATAGC

ACAC-3′。

2.含有权利要求1所述寡核苷酸的检测发热伴血小板减少综合征病毒的恒温扩增试剂盒，包括以下组分：

(1)RNA提取试剂；

(2)恒温扩增反应液，包括1×Bst Buffer、甜菜碱、MgSO4、dNTPs、RNase抑制剂、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、灭菌去离子水、所述上下游链置换引物、上下游探针和一条交叉扩增引物；

(3)阳性对照模板，为发热伴血小板减少综合征病毒M基因片段的体外转录产物；

(4)阴性对照，灭菌去离子水。

3.根据权利要求2所述检测发热伴血小板减少综合征病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于：所述恒温扩增反应液含有pH＝8.8 20mM Tris-HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2SO4、6mMMgSO4、0.1％TritonX-100％、8U Bst DNA聚合酶、10U AMV逆转录酶、1M甜菜碱、10U RNaseInhibitor、dNTPs各0.8mM、上下游链置换引物各0.1μM、上下游探针各0.3～0.5μM、交叉扩增引物0.5μM。

4.根据权利要求2所述检测发热伴血小板减少综合征病毒的恒温扩增试剂盒，其特征在于：所述阳性对照模板按如下步骤制备，以下游链置换引物和带有T7启动子的上游链置换引物对发热伴血小板减少综合征病毒的基因组RNA进行RT-PCR扩增；利用PCR产物纯化试剂盒对扩增产物进行纯化；以T7RNA聚合酶体外转录目的RNA片段；以紫外分光光度计测A260对RNA片段进行定量，将阳性对照模板稀释至105拷贝/μl，分装后-20℃保存。

5.权利要求2所述检测发热伴血小板减少综合征病毒的恒温扩增试剂盒非诊断目的的应用，包括以下步骤：

第一步、用RNA提取试剂从待检标本中提取病毒RNA；

第二步、将步骤一提取得到的病毒RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中；对照PCR管中分别加入阳性对照模板和阴性对照；60℃扩增反应60min；

第三步、将反应后的PCR管置入垂直流动核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，5min后判读实验结果：当试纸条的质控线和检测线均呈红色时，为阳性，说明样品中含有发热伴血小板减少综合征病毒核酸；当试纸条的质控线呈红色，而检测线为无色时，为阴性，说明样品中不含有发热伴血小板减少综合征病毒核酸；当试纸条的质控线呈无色时，无论检测线是否为红色，均表明实验失败，需对样品进行重复检测。