[发明专利]一种人Annexin V基因优化序列及其制作方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种人Annexin V基因优化序列及其制作方法和应用。

背景技术

人膜联蛋白V(Annexin V)是钙离子依赖的磷脂结合蛋白--Annexin家庭成员之一。共有320个氨基酸，分子量约35.8 KDa，存在于大多数真核生物细胞内，在多种组织细胞(如心肌细胞、血管内皮、骨骼肌、肝细胞等)中都有表达。在Ca²⁺存在时，对酸性磷脂分子有很高的亲和力，在体内具有多种生理功能，在细胞中参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动，包括胞吐作用中的膜融合、信号传导和钙离子通道的形成、抗凝、抗炎症反应、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等。

目前Annexin V蛋白主要应用在细胞凋亡检测领域。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是由基因调控的细胞主动的有序性死亡方式，是生物体调节和维持机体相对平衡的重要方式，与多种疾病病理密切相关。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl—serine，PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V高度特异性亲和PS，将Annexin V进行荧光素（FITC，Alexa Fluor 488，PE等）或生物素标记，可作为一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS，利用流式细胞仪或者荧光显微镜观察细胞凋亡现象。这是目前公认的灵敏、高效和特异的凋亡细胞的检测方法[Sgonc R，Gruber J．Aptoptosis detection：An Overview Experimental[J]．Exp Gerontol，1998，33：525～533．]。

人Annexin V蛋白的应用广泛，但是天然来源的人Annexin V含量低，无法批量提供，商业上需要大量重组表达人Annexin V蛋白，但是人Annexin V在大肠杆菌中用普通方法诱导表达时经常以包涵体形式存在，可溶性蛋白产量较低，不符合实际应用的需求。根据最新研究报道，人Annexin V产量最高的重组表达方法是采用流加发酵的生产方式，在大肠杆菌中产率达到28.5mg/1L培养基[Marder L,S et al. BMC Biotechnology 2014，14-33]，但对生产设备和工艺要求较高，不容易扩大规模生产。而本专利发明人利用基因工程技术，对人Annexin V编码基因进行优化，在大肠杆菌表达系统中，用最简单的生产方法高效表达可溶性人Annexin V蛋白，一步法纯化，重组蛋白产率达200mg/1L培养基，这一方法可低成本，批量获得高纯度、有生物学功能的人Annexin V纯品，解决了一直以来人Annexin V蛋白难重组表达的问题，大大降低凋亡检测试剂盒生产成本，具有很好的市场应用前景。

发明内容

为解决上述问题本发明提供了一种人Annexin V基因优化序列及其制作方法和应用。本发明解决了一直以来人Annexin V蛋白难重组表达的问题，大大降低凋亡检测试剂盒生产成本，具有很好的市场应用前景。为达到上述技术效果，本发明的技术方案是：

一种人Annexin V基因优化序列，人Annexin V基因优化序列的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。

一种人Annexin V基因优化序列的制作方法，包括如下步骤：

步骤一）在基因数据库中获取人Annexin V基因；

步骤二）基因优化：对人Annexin V基因的编码区进行大肠杆菌密码子偏爱性的基因优化得到优化序列；优化序列编码的氨基酸与人Annexin V基因编码形成的氨基酸序列一致；

步骤三）添加酶切位点：在优化序列的5′端添加一种内切酶的酶切位点，在优化序列的3′端添加另一种内切酶酶切位点，得到合成序列；

步骤四）基因合成：对得到的合成序列进行全基因合成。

进一步的改进，所述步骤三）中，优化序列的5′端添加NdeI酶切位点，优化序列的3′端添加XhoI酶切位点。

进一步的改进，所述步骤二）中的优化序列为SEQ ID NO: 1。

一种含有SEQ ID NO: 1序列的质粒。

进一步的改进，所述质粒为pET23a质粒 。

进一步的改进，SEQ ID NO: 1序列插入到pET23a质粒的NdeI酶切位点和XhoI酶切位点之间。

一种含有SEQ ID NO: 1序列的原核生物。

进一步的改进，所述原核生物为大肠杆菌。