[发明专利]拟南芥AtACS2基因在棉花抗旱和早熟方面的应用

说明书

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及拟南芥ACS2基因（AtACS2）基因在棉花抗旱和早熟方面的应用。

背景技术

干旱缺水危害作物生产。缺水因素主要包括：一是环境干旱缺水，由于雨水分布不均、季节性缺水等因素造成的植物无水分可利用；二是植物对水分利用环节障碍，由于低温冷害可以造成植物根部对水分的吸收和运输能力低下、细胞中水分运输和利用障碍，而高温造成植物体内水分蒸发过多等。以我国中北部棉花生产为例：棉花营养生长期间经常遭遇夏季高温、干旱缺水等胁迫，而棉花收获时期经常遭遇秋末季节的“干旱、早霜冻”等不利气象条件。这些不利因素危害棉花对水分的吸收和利用，其结果造成棉花“未熟先衰”、棉纤维产量和质量下降。棉花成熟越晚，遭受这些灾害的机会越大。因此，“早熟而不早衰”是棉花生产追求的农艺性状之一。

研究认为：植物激素乙烯及其前体物质1-氨基环丙烷羧酸（1-amino- cyclopropane -1 -carboxylic acid，ACC）是植物生长发育主要调节剂，在感受环境变化并调节自身生长发育过程中担当信号分子。植物体内ACC含量变化与植物应对缺水干旱反应的关联机制一直被关注。当遭遇干旱胁迫时，植物体组织中的ACC及乙烯含量发生显著变化。ACC合酶（ACC synthase, ACS）负责体内ACC生物合成。有意思的是：各种ACS同工酶功能冗余，但在应对不同生长发育信号、环境刺激时可能具有专一性，比如：参与果实成熟与调节干旱或盐渍反应的ACS成员是不一样的；单个的ACS活性变化不一定引发植物体内乙烯含量变化，但可以引发显著的生理反应。因此，进一步分析不同的ACS活性变化与其引发的植物生理反应特点，阐释其在忍受干旱反应中的功能专一性，具有理论意义和实际应用价值。

陆地棉（Gossypium hirsutum L.）基因组中的ACS2（GhACS2）与拟南芥ACS2(AtACS2)同源性很高（63.17%，见图1）。研究已表明，GhACS2是调节棉纤维伸长的关键因子。但是，目前尚不知ACS2表达活性是否与棉花成熟与衰老进程有关，水分吸收与利用是否影响其相关的成熟与衰老进程。

发明内容

本发明在观察模式植物拟南芥AtACS2参与调节水分吸收和成熟进度的基础上，对其在棉花抗旱、生长发育调节（早熟）方面的应用做了进一步研究分析，从而为耐旱新品种棉花的开发提供了新的借鉴和参考。

本发明所采取的技术方案如下。

拟南芥AtACS2基因在棉花抗旱和早熟方面的应用，该基因编号为At1g01480，其CDS长度为1491bp，编码496个氨基酸，所编码蛋白属于ACC合成酶同功酶一种；

将该基因加强表达后转染棉花，即可获得抗旱、早熟不早衰的转基因棉花新品系或品种，所述棉花为普通陆地棉（Gossypium hirsutum L.）。

所述拟南芥AtACS2基因在棉花抗旱和早熟方面的应用，拟南芥AtACS2基因加强表达

并转染棉花的过程采用将能够启动AtACS2过表达的“强启动子+ACS2编码序列”的遗传载体转入普通陆地棉的方式进行，具体过程如下：

（1）将拟南芥AtACS2的CDS序列连接到载体上，构建重组表达载体；所述载体为pCMBIA super1300（pSuper1300）载体，具体过程为：

首先，以拟南芥AtACS2总RNA为模板，反转录制备cDNA。同时根据拟南芥网站提供的信息，设计分别带有SpeI酶、SacI酶的酶切位点的特异性引物，引物序列设计为：

上游引物：5'-CCGCGATGCCAGCTACCGATCCCAATTTCA-3'，该引物序列带有SpeI酶切位点；

下游引物：5'-ATCGCAGCTACCCAGTTTAGCACC-3'，该引物序列带有SacI酶切位点。

以反转录制备的cDNA为模板进行相应基因序列扩增（PCR），将所得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行扩增产物（基因片段）回收，即获得拟南芥AtACS2的CDS序列。

其次，将所获得的AtACS2的CDS序列与载体pCMBIA super1300以SpeI酶和SacI酶为酶切位点，分别进行双酶切；酶切产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，采用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系中基因和质粒的摩尔浓度比为3:1，构建重组质粒表达载体pSuper1300-AtACS2。