[发明专利]重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的编码基因，其特征在于，编码该融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

2.一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤（1）重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白表达基因表达质粒的构建；

步骤（2）表达质粒转化至毕赤酵母中并诱导表达筛选重组子；

步骤（3）重组子发酵，得到发酵液上清；

步骤（4）将步骤（3）得到的发酵液上清纯化制得融合蛋白；

其中，编码所述融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白表达基因表达质粒的构建包括以下步骤：

将序列表SEQ ID No.1所示序列的DNA片段合成后连接到pMD-18T载体上，形成pMD-18T-(GLP-1A2G)₂-HSA质粒,将质粒转化至DH5α中进行克隆,提取单克隆质粒，用两种限制性内切酶双酶切，酶切产物以重量比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用Agarose Gel DNAPurification Kit回收目的基因，与经过两种限制性内切酶双酶切的酵母表达载体连接，构建出重组质粒。

4.根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为SacⅡ和XhoⅠ，所述酵母表达载体为pPICZα，所述重组质粒为pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA。

5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中表达质粒转化至毕赤酵母中并诱导表达筛选重组子包括以下步骤：将重组质粒线性化处理后电击转化所述毕赤酵母，转化结束后立即加入山梨醇，混匀后涂布于YPDZ平板，培养至菌落出现，筛选阳性克隆得到重组子一；将得到的重组子一接种于装有50mlBMGY培养基的三角瓶中，30℃、300r/min培养至A₆₀₀值为2.0-6.0，离心收集菌体，然后用BMMY培养基重悬细胞至A₆₀₀值为1.0，30℃，300r/min下进行发酵培养，每隔24h补加一次甲醇，诱导表达96h后，离心取菌液上清，SDS-PAGE分析，筛选得到重组子二。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）重组子发酵，得到发酵液上清包括以下步骤：将筛选得到的重组子二接种于YPD液体培养基，30℃、250～300rpm条件下培养16～24小时，直到OD600=2～6作为种子液，接种前用氨水将发酵培养基pH调到5.0，温度设定为30℃，溶氧始终大于20％饱和度；然后将种子液以5～10％的接种量接种基础盐培养基；培养直到甘油被完全耗尽后，开始补加50%的甘油补料，所述甘油补料每升中需添加12mlPTM1微量盐，设定补加甘油速率为18.15ml/小时/升初始发酵液体积；至菌体湿重180～220g/L时，停止补加甘油补料，甘油耗尽维持饥饿状态0.5～1h后，开始补加100％甲醇补料，所述甲醇补料每升中含12mlPTM1微量盐，进入诱导阶段,诱导前用氨水将培养基pH调到5.5，温度设定为22℃，开始补加甲醇补料；维持溶氧20%以上，诱导94-98小时下罐，离心收集发酵液上清。