[发明专利]重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种重组人胰高血糖素样肽‑1突变体融合蛋白及其制备方法，编码该融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1；制备方法包括将发酵所含有重组人胰高血糖素样肽‑1突变体融合蛋白的发酵上清依次经过染料亲和层析、阳离子交换层析和分子筛层析得到高质量的重组人胰高血糖素样肽突变体融合蛋白。本发明的有益效果是：提供一种适宜于规模扩大化生产的、快速、高效、简便的重组人胰高血糖素样肽‑1突变体融合蛋白的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别地涉及一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法。

背景技术

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种多病因的代谢性疾病，其特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌和/或作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。临床研究发现，Ⅰ型糖尿病，以往称为胰岛素依赖型糖尿病，约占糖尿病病人总数的15%左右，常发生于儿童和青少年，但也可发生于其它年龄，甚至80-90岁时也有患病的可能。Ⅱ型糖尿病，又称为非胰岛素依赖型糖尿病，约占糖尿病病人总数的80%以上。据统计目前全球有Ⅱ型糖尿病患者1.6亿，我国达4000多万人，其发病率正呈迅速上升之势，在发展中国家(包括中国)尤为显著，预测到2025年，全球将增至3.8亿人。依据目前的医疗手段，糖尿病无根治办法。因此，糖尿病已经成为当前威胁人类健康的重要疾病，其对人体的危害仅次于癌症。

世界上治疗Ⅱ型糖尿病以磺酰脲类药物为主，辅以双胍类、α-糖苷酶抑制剂等药物。但是磺酰脲类药物的副作用大，长期使用会因为胰岛素过度分泌而导致胰岛β细胞衰竭。胰岛β一细胞功能衰竭，体内胰岛素绝对或相对缺乏，是导致糖尿病的根本原因。因此寻找新一代治疗Ⅱ型糖尿病药物的开发热点之一。人胰高血糖素样肽-1(human glucoganlike peptide-l，hGLP-1)是由肠道L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽。国内外研究显示hGLP-1是迄今已知的诱导胰岛素分泌能力最强的物质，可以促进胰岛素基因转录和胰岛素分泌，提高受体对胰岛素的敏感性，消除胰岛索抵抗所引发的各种并发症，且它降低血糖的作用依赖于患者血糖的浓度，用药后不会造成低血糖。此外，hGLP-1还可抑制胃的排空、控制食欲、减轻体重、消除患者饥饿感和糖尿病典型的“三多”症状，在降血脂和预防冠心病方面也有一定的作用。除了调节血糖，hGLP-1最显著的功能是促进胰岛β-细胞功能再生，防止胰岛β-细胞凋亡。然而，hGLP-1的活性形式是hGLP-1(7-36)，hGLP-1(7-36)在体内很快被一种蛋白酶—二肽酰基肽酶Ⅳ(dipeptidyl-peptidaseⅣ，DPPⅣ)从N末端降解2个氨基酸残基而变成一种无活性的hGLP-l(7-36)。因此hGLP-1(7-36)在体内的半衰期不足5 min，其新陈代谢的时间为12～13 min。hGLP-1(7-36)较短的体内半衰期决定了只有频繁、反复地给药才能取得令人满意的疗效，这就极大地限制了它的临床应用及疗效，还给病人造成了不必要的麻烦和痛苦。

为了克服上述缺点，开发长效的hGLP-1(7-36)突变体是目前的研究热点。该裂解主要受体内丝氨酸蛋白酶-DPPⅣ的催化，因为hGLP-1(7-36)序列第8位丙氨酸（Ala）可被DPPⅣ特异性所识别，为了保护hGLP-1不被DPPⅣ所降解，延长其在体内的生物半衰期，可以用甘氨酸（Gly）代替第8位丙氨酸（Ala）对hGLP-1的N-末端进行修饰。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）融合技术是构建长效蛋白类药物的有效技术手段，已在多种药物研究中得到应用。所谓的白蛋白融合技术利用白蛋白分子质量大的性状将药物蛋白易致机体产生过敏反应的部分折叠包入其内，暴露药物蛋白活性区域，使其位于融合蛋白的表面。这种处理手段的优点不但可显著降低产品的过敏反应，还可防止机体酶系统对药物蛋白的降解，提高产品的稳定性和延长其疗效。人血白蛋白融合技术与化学修饰相比，不需要额外的化学修饰，生产工艺简单，产物均一，质量控制相对容易，延长药物半衰期的效果可能比化学修饰更有效。