[发明专利]一种薄壳山核桃细胞胚胎组织培养的方法

权利要求书

1.一种薄壳山核桃细胞胚胎的组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）选材：选取4年生薄壳山核桃优选单株的当年生萌条，将其剪成5~6cm的带芽小段；

（2）对带芽小段外植体进行消毒处理；

（3）芽诱导培养：在无菌条件下，将步骤（2）中的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化变黑部分，直接种于芽诱导培养基中培养11~20d，分化长成无菌芽苗；所述芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.05~0.08mg.L^-16-BA、  0.05~0.06mg.L^-1NAA、25~40g.L^-1蔗糖、18~21 g.L^-1蜂胶乳油、11~13 g.L^-1柠檬酸、6.5~7.0 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.2~5.4；

（4）体胚诱导：将步骤（3）中长成的无菌苗嫩叶接种到体胚诱导培养基中培养15~30d；体胚诱导培养基配方为：MS基本培养基，附加0.16~0.20 mg. L^-16-BA、0.2~0.3mg. L-1NAA、0.08~0.12 mg. L-12,4-D、0.05~0.06mg.L-1  玉米素，25~40g.L-1蔗糖、9.5~11.0g.L-1酵母膏、6.5~7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8；

（5）体胚增殖培养：将步骤（4）中诱导产生的体胚，进行增殖培养，20~25d后，体胚迅速增殖呈黄色透明颗粒状；体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.8~2.0 mg. L-16-BA、0.01~0.03 mg. L-1NAA、25~40g.L-1蔗糖、6.5~7.0 g.L-1卡拉胶、0.05~0.08mg. L芸苔素内酯、0.03~0.06mg.L长春碱，调pH值为5.7~5.8；

（6）成熟培养：将步骤（5）中增殖获得的体胚，接种于含有成熟培养基的培养瓶中培养32~51d；体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加40~60g.L^-1蔗糖、6.5~7.0 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8；

（7）体胚的萌发：将步骤（6）中获得的成熟体胚接种于萌发培养基中培养42~58d进行植株再生；所述体胚萌发培养基配方为：MS基本培养基，附加8~12 g. L^-1山梨醇、20~30g.L^-1蔗糖、6.5~7.0 g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7~5.8 ；

所述的MS基本培养基的具体配方如下：

硝酸钾KNO3    　　　1900 mg/L

硝酸铵NH4NO3      　1650 mg/L

磷酸二氢钾KH2PO4      　170 mg/L

硫酸镁MgSO4.7H2O     370 mg/L

氯化钙CaCl2.2H2O 　　440 mg/L

碘化钾KI   　　　　　0.83 mg/L

硼酸H3BO3     　　　　6.2 mg/L

硫酸锰 MnSO4.4H2O   22.3 mg/L

硫酸锌　ZnSO4.7 H2O        8.6 mg/L

钼酸钠 Na2MoO4.2 H2O     0.25 mg/L

硫酸铜　CuSO4.5 　     0.025 mg/L

氯化钴 CoCl2.6 H2O    　　　0.025 mg/L

乙二胺四乙酸二钠 Na2.EDTA   37.3 mg/L

硫酸亚铁FeSO24.7H2O       27.8 mg/L

肌醇     　　　　　　　　　100 mg/L

甘氨酸        　　　　　　　2 mg/L

盐酸硫胺素VB1     　　　　0.1 mg/L

盐酸吡哆醇　VB6 　　　   0.5 mg/L

烟酸VPP     　　　　　　　0.5 mg/L

羧甲基纤维素钠           0.9 mg/L。