[发明专利]一种薄壳山核桃细胞胚胎组织培养的方法

说明书

技术领域

本发明涉及薄壳山核桃的组织培养方法，具体的说是薄壳山核桃的体细胞胚胎组织培养方法。

背景技术

薄壳山核桃，又名美国山核桃，系胡桃科、山核桃属中的一个种。原产美国和墨西哥，是世界上重要的油料干果树种之一，其壳薄易剥、仁肉肥厚、味香可口，具有较高的营养价值。树干通直、树形优美、根深叶茂，是四旁绿化及园林观赏的优良树种。同时木材坚韧致密、心材暗红、边材黄白、富弹性、不易变形和开裂，是建筑、高级家具等优良用材树种。因此，薄壳山核桃是一个用途广、受益期长、经济效益高、社会效益和生态效益明显的优良经济树种。

我国自20世纪初即开始进行薄壳山核桃的引种栽培，但是由于其结果迟、适合各地的优良品种缺乏等因素，目前薄壳山核桃在我国尚呈零星分布，真正形成产量的、稳产高产的果用园尚不多见。且虽然薄壳山核桃种子春、秋均可播种。无论是春播还是秋播，种子易被鼠、鸟啃食。有时天气干旱，种子失水，出苗率低。春播一般在3月下旬或四月上旬进行。但是不管是春播或者是秋播，一年生的实生苗很难可以达到可嫁接的程度，生长缓慢。为了使得薄壳山核桃尽快踏上良种化、基地化建设的进程，在良种催芽培养的同时，着手进行砧木嫁接技术攻关，但是由于嫁接成活率不高，导致嫁接苗供不应求，因此，只好栽培实生苗，然而实生苗存在投产迟、坚果小，适应性差等缺陷，市场上不受欢迎，因此，制约生产发展的关键因素有两个，一个是缺乏充足的优良品种苗木，另一个是缺乏科学系统的栽培技术。

本领域技术人员也从事种植大量薄壳山核桃育苗工作，重点进行了薄壳山核桃扦插和嫁接等无性繁殖实验，但繁殖系数较低，苗木质量参差不齐，现有技术中薄壳山核桃的无性繁殖技术仍停留在尝试性试验阶段，还没有形成一种可以大量推广和重复验证的成熟方法。因此，提供一个系统的薄壳山核桃育苗方法是本领域急待解决的技术问题。为满足生产方面的需求，我们对常规播种的方法进行了改良，并对嫁接方法进行创新，以达到缩短育苗周期、增加育苗数量的目的。

发明内容

发明目的：建立薄壳山核桃胚发生技术体系，实现薄壳山核桃优选单株规模化高效生产。

技术方案：本发明提供了一种薄壳山核桃细胞胚胎的发生方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)选材：选取4年生薄壳山核桃优选单株的当年生萌条，将其剪成5～6cm的带芽小段；

(2)对带芽小段外植体进行消毒处理；

(3)芽诱导培养：在无菌条件下，将步骤(2)中的外植体用剪刀去除茎段头尾氧化变黑部分，直接种于芽诱导培养基中培养11～20d，分化长成无菌芽苗；所述芽诱导培养基的配方为：WPM基本培养基，附加0.05～0.08mg.L^-16-BA、0.05～0.06mg.L^-1NAA、25～40g.L^-1蔗糖、18～21g.L^-1蜂胶乳油、11～13g.L^-1柠檬酸、6.5～7.0g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.2～5.4；

(4)体胚诱导：将步骤(3)中长成的无菌苗嫩叶接种到体胚诱导培养基中培养15～30d；MS基本培养基，附加0.16～0.20mg.L^-16-BA、0.2～0.3mg.L^-1NAA、0.08～0.12mg.L^-12,4-D、0.05～0.06mg.L^-1玉米素，25～40g.L^-1蔗糖、9.5～11.0g.L-1酵母膏、6.5～7.0g.L-1卡拉胶，调pH值为5.7～5.8；

(5)体胚增殖培养：将步骤(4)中诱导产生的体胚，进行增殖培养，20～25d后，体胚迅速增殖呈黄色透明颗粒状；体胚增殖培养基配方为：MS基本培养基，附加1.8～2.0mg.L^-16-BA、0.01～0.03mg.L^-1NAA、25～40g.L^-1蔗糖、6.5～7.0g.L^-1卡拉胶、0.05～0.08mg.L芸苔素内酯、0.03～0.06mg.L长春碱，调pH值为5.7～5.8；

(6)成熟培养：将步骤(5)中增殖获得的体胚，接种于含有成熟培养基的培养瓶中培养32～51d；体胚成熟培养基配方为：MS基本培养基，附加40～60g.L^-1蔗糖、6.5～7.0g.L^-1卡拉胶，调pH值为5.7～5.8；