[发明专利]一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的方法，属于免疫学技术领域，具体涉及的是一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法。

背景技术

金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，简称SEs)，是一种由金黄色葡萄球菌分泌的细胞外毒素，其会导致中毒休克、食物中毒及一系列过敏性及免疫学疾病。目前已发现的肠毒素有23种血清型，其中SEA-SEE称为传统肠毒素，SEG-SEX为新型肠毒素。SEM属于新型肠毒素类型，其理论分子量为24.842KD。据文献报道，sem基因以基因簇（egc）的形式存在。由于肠毒素基因簇受同一操纵子调控。据调查显示，目前在多药耐药性菌株中约77.8%含有基因簇（egc）。基于sem基因流行的广泛性，新型肠毒素SEM也潜在威胁人类的健康。因此，食品及原料中SEM的检出，对于控制由金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM引起的食源性疾病具有重要意义。

目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法主要有免疫学法、分子生物学法和生物传感器法。基于PCR技术的分子生物学方法从基因水平进行诊断，可以检测大量样品，具有高灵敏度和特异性，可检测各类金黄色葡萄球菌的肠毒素基因。但PCR法只能判断葡萄球菌携带肠毒素的基因型，胞外肠毒素蛋白的表达往往受时间、水分活度（AW 0.85~0.99）、酸碱度（pH 4.0~7.0）和温度（8℃~30℃）等因素的影响，用PCR方法很难准确测定食品或临床样本中肠毒素蛋白的含量。

生物传感器技术因其具有自动化、检样量少、分析速度快、生物功能膜可多次使用等优点受到国内学者的亲睐。目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素用的较多的生物感应器主要为免疫感应器。最新研发的电化学免疫传感器检测B型肠毒素，其最低检出限可达0.017ng/mL。该技术目前也仅限于检测传统的肠毒素，并且由于该方法检测成本高，检测稳定性较差，该方法的发展受到限制。

免疫学检测法依靠抗原抗体的结合，只发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，因此，免疫学检测法具有高度的特异性。酶联免疫吸附（ELISA）法因其具有操作简单、低成本、灵敏度高，特异性强、重复性强、稳定性高等优点，成为国内外研究热点。

对于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测，现有的利用双抗体夹心法检测传统A型肠毒素的技术较为成熟，其灵敏度高达0.0282ng/mL。但利用双抗体夹心法检测新型肠毒素的报道不多，对于一系列新型肠毒素（SEG-SEX）如SEM等的双抗夹心检测方法的研究将具有相当广泛的应用价值。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种即可定性分析、也可定量检测，且灵敏度高、准确度高的检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹心法，包括以下步骤：

（1）用包被抗体包被酶标板，洗板，用于洗去未与酶标板结合的包被抗体，该包被抗体为SEM单克隆抗体；

（2）加入封闭液对酶标板上多余结合位点进行封闭，洗板，用于洗去酶标板上多余封闭液；

（3）在酶标板上加入样品，孵育后洗板；

（4）以SEM兔抗血清为一抗加入酶标板，反应后洗板，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为酶标二抗，反应后洗板；

（5）加入显色液使酶标板显色，然后加入硫酸终止反应，用酶标仪检测OD₄₅₀，

（6）将检测得到的OD₄₅₀值带入标准曲线即可求得样品中SEM的含量；

当样品中SEM浓度≥0.5 ng/mL，样品中SEM被配对抗体捕获与酶标二抗结合，并催化底物在450 nm产生吸收值时，被判定为阳性；

当样品中SEM浓度＜0.5ng/mL，样品中SEM不被配对抗体捕获或者捕获数量太小不足以引起足够的信号时，被判定为阴性。

本发明记载的方法对不同浓度的标准SEM进行OD₄₅₀值检测后，得到的线性范围良好，可以直接做成标准曲线，通过对样品的OD₄₅₀值检测后，用该值在标准曲线上找出对应的浓度，即可实现对样品的定量检测。