[发明专利]含Endothelin-1的人类卵母细胞体外成熟培养液和应用

说明书

本发明提供了一种含有Endothelin‑1的人类卵母细胞体外成熟培养液，由A液和B液组成，A液：ET‑1，r‑FSH，体积分数10%SSS；B液：ET‑1，r‑FSH，hCG，体积分数10%SSS，溶剂均为常规基础培养液。本发明通过研究证明该培养液和培养方法具有促进人卵母细胞体外成熟，尤其是胞质成熟的能力，并可提高卵母细胞体外受精后的胚胎发育潜能。本发明是根据人未成熟卵母细胞体外培养时胞质与细胞核发育不平衡影响胚胎体外发育潜能的现状，结合ET‑1在卵丘细胞中的生物学功能和作用研制而成，所述培养液可在体外进行人卵母细胞培养中的应用，有助于优化IVM过程，值得推广应用。

技术领域

本发明属于生殖医学的生物医学技术领域，涉及一种含有Endothelin-1（ET-1）的人类卵母细胞体外成熟培养液，以及在进行人类未成熟卵母细胞体外成熟培养中的应用。

背景技术

人卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, IVM)是指通过体外培养，使卵泡内的未成熟卵母细胞发育成为成熟的第二次减数分裂中期(MⅡ)卵母细胞，受精分裂成胚胎并移植获得妊娠的技术。与常规的体外授精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryotransfer）相比，IVM可以降低大剂量促排卵药物费用，节约就医时间，更重要的是可以避免药物刺激卵巢带来的副作用。而在生殖医学的某些领域，IVM更是有不可替代的作用，如：对有卵巢过度刺激综合症风险的病人进行IVM可最大程度避免卵巢过度刺激综合症的发生；在更安全的条件下，实现肿瘤患者的生育能力保存；为卵子捐赠提供无需刺激的捐赠途径等。虽然IVM技术有着广泛的应用前景，但由于体外成熟的卵母细胞进行体外受精后，其受精，分裂和囊胚形成率均显著低于IVF技术，所以IVM技术的成功率仍不能与常规IVF技术相比。

在人类卵母细胞体内成熟环境中，卵子处在完整的卵泡中，卵细胞和卵丘细胞、颗粒细胞、卵泡膜细胞等形成了一个复杂精细的微环境调节系统，使细胞质和细胞核高度同步化发育。只有模仿卵泡的微环境才能提高体外成熟卵细胞的成熟率、受精率和发育潜能。目前IVM技术虽然已经有很大提高，但因对卵母细胞发育成熟机制及所需环境条件认识有限，IVM仍有许多问题亟待解决。

在目前已经推广应用人类的ART技术中，IVM成功率最不稳定。其中突出的问题是细胞核与细胞质成熟的不同步。IVM将未成熟的卵母细胞从中等大小的卵泡中分离出来，致使卵母细胞成熟环境受到影响和干扰。体外培养虽可以获得一定比例的自发细胞核成熟，但是细胞质成熟常不能同步完成，致使卵母细胞缺乏某些支持胚胎发育的关键细胞质成分，出现部分生长因子的表达和印记改变，发生染色体和纺锤体结构异常，进而导致IVM卵母细胞受精和胚胎发育能力下降。

ET-1是内皮素(endothelin, ET)家族的一个重要成员,具有重要的生理功能。ET-1以及EDNRA基因敲除小鼠在出生后不久死去。ET-1在呼吸、心血管、泌尿各系统起调节作用并能影响肿瘤的发生、发展、转移。此外，ET-1在生殖激素调节、妊娠、分娩等生殖过程中也起着重要作用。我们前期研究发现hCG可以刺激卵巢的颗粒细胞和卵丘细胞产生ET-1，并与卵丘细胞上的ET-1 A受体（endothelin receptor type A, EDNRA）结合，从而突破次黄嘌呤维持的减数分裂阻滞，使减数分裂重启，促进卵母细胞的成熟。

到目前为止，尚未见有关ET-1应用于人类卵母细胞体外成熟技术领域的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有ET-1的人类卵母细胞体外成熟培养液，所述人卵母细胞体外成熟培养液组成如下：A液：ET-1 100ng/ml，0.075IU/ml r-FSH，体积分数10%人血清替代物（Serum Substitute Supplement, SSS），溶剂为常规基础培养液；B液：ET-1100ng/ml，0.075IU/ml r-FSH，0.5IU/ml hCG，体积分数10%SSS，溶剂为常规基础培养液。基础培养液是指G-IVF。