[发明专利]脐带间充质干细胞的大量培养方法

说明书

技术领域

本发明属于干细胞制备领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞的大量培养方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能，是组织工程研究中重要的种子细胞来源。由于脐带沃顿胶(或者又称华通氏胶、华尔通胶)中含有丰富的间充质干细胞，所以间充质干细胞的大量制备多采用从脐带中分离培养得到，而制备的方法一般为组织块贴壁法和酶消化法。通常的酶消化法采用胶原蛋白酶和胰蛋白酶消化脐带沃顿胶组织后进行大量培养，这一方法中胰蛋白酶是通过离解细胞间的粘蛋白、糖蛋白而影响细胞骨架从而使细胞分离，对细胞间质的蛋白成分及细胞膜蛋白均有很强的破坏作用，因此造成分离到的干细胞受到损伤导致活性不佳，难以扩增出理想数目和活性的间充质干细胞。

基于上述，在需要大量制备低损伤的脐带间充质干细胞时，多采用组织块贴壁培养进行；但是现有通常的组织块贴壁方法时间长，前期获取率不高，且工程操作量巨大。比如采用到培养至所需的P2代时，一根脐带经过培养得到的细胞数量可以达到30亿以上，这样数量的细胞需要T175培养瓶的数量可能达到500之多，并且由于细胞贴壁的能力也不完全，介于是半贴壁的程度增加操作难度(比较容易脱落流失)，所以细胞回收的过程是极大的工作量。而且培养的过程中，由于前期组织块浸润培养基生长至细胞溢出的培养方式，所培养得到的细胞的分裂程度和分化程度都不同，容易在后期获得细胞均一性不足，导致组织块贴壁方法大量培养在使用中还是存在多种限制。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有组织贴壁进行间充质大量培养产生细胞存在分化不均一且难收集的缺陷，提供一种脐带间充质干细胞的大量培养方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种脐带间充质干细胞的大量培养方法，包括如下步骤：

获取脐带沃顿胶；

将所述脐带沃顿胶进行P0代培养至细胞融合度为40％～50％；

将所述P0代培养的细胞传P1代培养至细胞融合度为85％～95％，收获P1代细胞；

将所述P1代细胞于平板培养基进行接种培养，分离未被平板培养基粘附的悬浮细胞；

将所述悬浮细胞于含有白血病抑制因子和成纤维样生长因子的培养基传P2代培养。。

本发明的上述组织贴壁培养的方法，基于新鲜沃顿胶组织原始培养中，细胞性状分化、变异和扩增能力并不高，在早期P0细胞本身发生多向性变化较低，所以直接培养至P1代后，将P1代的细胞用组织培养平板进行粘附筛选，获取未分化或者分化程度较低的细胞P1代细胞，保持细胞分化度的均一；之后用白血病抑制因子和成纤维样生长因子增加细胞在P2代培养中的贴壁性能以及抑制分化，从而得到分化度较低且趋于一致、贴壁能力较强利于收集的脐带间充质干细胞的。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种脐带间充质干细胞的大量培养方法，包括如下步骤：

S10，获取脐带沃顿胶；

S20，将脐带沃顿胶接种至培养瓶中进行培养至细胞融合度为40％～50％；

S30，将步骤S20培养的细胞进行P1传代培养至细胞融合度为85％～95％；

S40，将步骤S30的P1传代培养的细胞于组织培养板进行接种培养，分离未被组织培养板粘附的细胞；

S50，将步骤S40获得的细胞于含有白血病抑制因子和成纤维样生长因子的培养基传P2代。

本发明的上述组织贴壁培养的方法，基于新鲜沃顿胶组织原始培养中，细胞性状分化、变异和扩增能力并不高，在早期P0细胞本身发生多向性变化较低，所以直接培养至P1代后，将P1代的细胞用组织培养平板进行粘附筛选，获取未分化或者分化程度较低的细胞P1代细胞，保持细胞分化度的均一；之后用白血病抑制因子和成纤维样生长因子增加细胞在P2代培养中的贴壁性能以及抑制分化，从而得到分化度较低且趋于一致、贴壁能力较强利于收集的脐带间充质干细胞的。